趙艷霞 張廣梅 趙協(xié)慧

青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，青海西寧810000

高脂飲食對模擬低氧環(huán)境SD大鼠主動脈的影響

趙艷霞 張廣梅 趙協(xié)慧

青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，青海西寧810000

目的研究高脂飲食對模擬低氧環(huán)境SD大鼠主動脈的影響及其可能機(jī)制。方法20只雄性SD大鼠隨機(jī)分為低氧組和低氧聯(lián)合高脂飲食組，普通飲食或高脂飲食，4周后留取外周血及主動脈標(biāo)本，采用TBA比色法檢測血漿丙二醛(MDA)含量、WST-1法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活力、硝酸還原酶法檢測硝酸鹽/亞硝酸鹽(NOx)水平、終點法和直接檢測法檢測血脂含量，HE染色觀察主動脈病理形態(tài)改變，Western blot法檢測主動脈內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果病理切片顯示低氧組大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，局部內(nèi)膜脫落，平滑肌細(xì)胞增生，低氧聯(lián)合高脂飲食組主動脈局部內(nèi)膜大片脫落，平滑肌細(xì)胞明顯增生，核變圓，胞漿空泡變明顯，細(xì)胞排列紊亂。低氧聯(lián)合高脂飲食組與低氧組主動脈蛋白表達(dá)水平無明顯變化。與低氧組（75.95±12.48）μmol/L,（0.26±0.0）4mmol/L,（1.55±0.10）mmol/L,（178.79±16.85）U/mL,（6.49±0.87）nmol/ mL比較，血漿NOX含量（23.19±7.10）μmol/L明顯降低，低密度脂蛋白（0.91±0.04）mmol/L與總膽固醇（2.36±0.22）mmol/L水平明顯升高；低氧聯(lián)合高脂飲食組大鼠血漿SOD活力（163.89±8.16）U/mL與MDA含量（4.31±1.10）nmol/mL顯著低于低氧組(P＜0.05)。結(jié)論低氧環(huán)境下，高脂飲食加重了SD大鼠主動脈損傷，其機(jī)制可能與抗氧化能力不足及血脂異常引起血漿NOX水平降低有關(guān)。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶；一氧化氮；低氧；高脂

內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化左旋精氨酸產(chǎn)生的一氧化氮(NO)有擴(kuò)張血管、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和抑制血小板聚集等作用，可調(diào)節(jié)血管張力、維持血管穩(wěn)態(tài)，對心血管系統(tǒng)具有多重保護(hù)作用，是臨床評定內(nèi)皮功能的重要指標(biāo)[1]。高脂血癥可降低常氧環(huán)境機(jī)體NO的生成與生物利用度，減弱其對血管的保護(hù)作用，引起內(nèi)皮損傷，平滑肌細(xì)胞增殖，啟動心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展[2]。高脂血癥對低氧環(huán)境人群主動脈存在怎樣的影響尚不明確。本研究通過觀察SD大鼠主動脈病理形態(tài)變化、檢測主動脈eNOS蛋白表達(dá)及血漿硝酸鹽/亞硝酸鹽(NOx)含量(間接反映NO含量)，探討高脂飲食對模擬低氧環(huán)境機(jī)體主動脈的影響及其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物2012年9月22日—10月26日，將20只體重180～200 g的6周齡清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性，中國藥科大學(xué)提供)隨機(jī)分為兩組：低氧(H)組與低氧聯(lián)合高脂飲食(H+ HFD)組，每組10只，于低壓氧艙模擬海拔5000 m。H+HFD組大鼠灌服脂肪乳劑，10 mL/kg/d，1次/d；H組大鼠灌服等體積生理鹽水，普通飲食。于4周末抽取大鼠靜脈血，置于抗凝管，并留取主動脈標(biāo)本于-80℃冰箱保存。

1.1.2 脂肪乳劑采用前期研究的方法制備脂肪乳劑[3]。

1.1.3 主要儀器和試劑冷凍離心機(jī)、DU800核酸蛋白儀(德國BECKMAN)，低壓氧艙室(貴州風(fēng)雷航空機(jī)械有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及一氧化氮(NO)試劑盒由南京建成生物公司提供，血脂檢測試劑盒、BCA蛋白分析試劑盒、eNOS及βactin一抗、二抗分別由北京利德曼生化股份有限公司、Pierce Chemical Company、Abcam公司、Santa Cruz Biotechnology lnc提供。

1.2 方法

1.2.1 主動脈病理形態(tài)觀察取主動脈標(biāo)本固定，脫水，包埋，切片，HE染色，觀察病理形態(tài)改變。

1.2.2 血漿SOD活力和MDA含量測定于3000 r/min離心抗凝血（10 min），分離血漿。用WST-1法、TBA比色法分別檢測血漿SOD活力及MDA含量。

1.2.3 血脂水平檢測采用直接測定法檢測血漿高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量，采用終點法檢測血漿總膽固醇(TCH)及甘油三酯(TG)含量。

1.2.4 血漿NOX水平檢測采用硝酸還原酶法檢測血漿NOX水平。

1.2.5 主動脈eNOS蛋白水平檢測將主動脈切成小塊，裂解組織，勻漿，離心，取上清，檢測樣品總蛋白濃度。用5×蛋白上樣緩沖液于100℃變性5 min。采用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白。使用半干轉(zhuǎn)印槽將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h，然后加兔抗eNOS(1:250)，β-actin(1:1000)，4℃孵育過夜。于洗膜后用辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(1:6000)室溫孵育2 h，使用ECL液發(fā)光顯影。膠片掃描后用ImageJ軟件分析，計算目的與內(nèi)參條帶積分光密度值的相對比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 主動脈病理形態(tài)變化

H組內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，核變圓，局部內(nèi)膜脫落，平滑肌細(xì)胞增生，細(xì)胞核變橢圓，局部胞漿疏松，細(xì)胞輕度排列紊亂；H+HFD組局部內(nèi)膜大片脫落，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，平滑肌細(xì)胞明顯增生，細(xì)胞核變圓，胞漿空泡變明顯，細(xì)胞排列紊亂，見圖1。

圖1 主動脈病理形態(tài)變化

2.2 血脂水平檢測

H+HFD組LDL、TCH含量明顯高于H組，兩組間的TG與HDL水平無明顯差異，見表1。

表1 兩組大鼠血脂水平變化(mmol/L±s)

表1 兩組大鼠血脂水平變化(mmol/L±s)

注：P＜0.05 vs H。

組別TCH TG LDL HDL H H+HFD tP 1.55±0.10 2.36±0.22△-9.666＜0.001 0.54±0.06 0.53±0.08 0.136 0.893 0.26±0.04 0.91±0.04△-32.869＜0.001 0.37±0.05 0.36±0.04 0.604 0.555

2.3 血漿MDA含量與SOD活力的測定

H+HFD組MDA含量與SOD活力均明顯低于H組，見表2。

2.4 血漿NOx水平測定

H+HFD組大鼠血漿NOx含量低于H組，見表2。

2.5 主動脈eNOS蛋白表達(dá)水平測定

H組(0.82±0.15)與H+HFD組(0.91±0.17)大鼠主動脈eNOS蛋白表達(dá)水平無明顯差異(t=-0.885,P=0.402)。

表2 兩組大鼠血漿MDA、SOD及NOx水平變化(±s)

表2 兩組大鼠血漿MDA、SOD及NOx水平變化(±s)

注：P＜0.05 vs H。

組別MDA(nmol/mL) SOD(U/mL) NOx(μmol/L) H H+HFD tP 6.49±0.87 4.31±1.10△4.384 0.001 178.79±16.85 163.89±8.16△2.251 0.041 75.95±12.48 23.19±7.10△10.394＜0.001

3 討論

本研究通過觀察SD大鼠主動脈病理形態(tài)變化、檢測主動脈eNOS蛋白表達(dá)及血漿NOx含量，探討高脂飲食對模擬低氧環(huán)境機(jī)體主動脈的影響及其機(jī)制。結(jié)果顯示，相對于低氧組，低氧聯(lián)合高脂飲食組主動脈病理損傷加重，eNOS蛋白表達(dá)水平無明顯變化，而血漿NOx含量明顯降低，血漿TCH及LDL明顯升高；低氧聯(lián)合高脂飲食組血漿SOD活力低于低氧組，表明高脂飲食可加重模擬低氧環(huán)境大鼠主動脈的損傷。

NO是高原適應(yīng)與習(xí)服的重要指標(biāo)之一，高原世居藏族循環(huán)血NO代謝產(chǎn)物高于低海拔人群的水平，可增加血流灌注及氧傳遞，以抵消低氧影響，而機(jī)體NO含量降低則可引起高原適應(yīng)不良[4-5]。本研究中低氧聯(lián)合高脂飲食組血漿NOx含量明顯低于低氧組，與文獻(xiàn)報道一致[6]，即高脂飲食可使模擬低氧環(huán)境SD大鼠血漿NO含量降低，減弱了其對血管的保護(hù)作用，加重了血管內(nèi)皮的損傷，導(dǎo)致內(nèi)膜大片脫落，平滑肌細(xì)胞明顯增生，細(xì)胞核變圓，胞漿空泡變，細(xì)胞排列紊亂。另外，血漿NO含量降低還可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，使其釋放擴(kuò)血管物質(zhì)減少，縮血管物質(zhì)增多，進(jìn)而加重了血管收縮與重構(gòu)[7]。提示對于慢性重度低氧性疾病的患者，高脂血癥可能是其動脈損傷加重的獨立危險因素。

本研究中，低氧聯(lián)合高脂飲食組大鼠血漿LDL與TCH濃度明顯高于低氧組，血脂異?？烧T導(dǎo)小窩蛋白，降低eNOS從質(zhì)膜上解離，降低eNOS的酶活性，即eNOS蛋白表達(dá)不降低而NO產(chǎn)生減少原因之一。同時，血脂異常還可引起機(jī)體抗氧化能力降低，即抗氧化指標(biāo)SOD活力降低。減弱其清除機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生過氧化物的能力，引起eNOS出現(xiàn)無用的代償性改變，致使eNOS脫偶聯(lián)[8]，減少NO生成，增加NO清除，降低其生物利用度。既往研究亦證實抗氧化能力不足致血管內(nèi)皮損傷及內(nèi)皮源性NO生成減少，補(bǔ)充抗氧化劑可糾正血管內(nèi)皮損傷[9]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明與單純低氧相比，聯(lián)合高脂飲食降低大鼠抗氧化能力，降低血漿NOx水平，加重了主動脈損傷。提示長期高脂飲食可能是慢性重度低氧環(huán)境機(jī)體主動脈損傷的獨立危險因素，其主要原因可能是抗氧化能力降低，應(yīng)積極干預(yù)和治療。但也有研究認(rèn)為聯(lián)合高脂飲食并未加重低氧環(huán)境大鼠血管損傷，分析原因可能與低氧的方式、程度及時間不同有關(guān)，需進(jìn)一步研究證實[10]。因大鼠與人體間存在差異，高脂飲食對慢性重度低氧環(huán)境人主動脈的影響不能由本研究結(jié)果完全反映，有待進(jìn)

一步的研究。

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R4

A

1672-5654（2014）09（c）-0157-03

2014-07-10）

趙艷霞（1980-），女，漢族，黑龍江省安達(dá)市，碩士研究生，講師，主要從事心血管病研究。