史銳 馬賢德

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847

自擬消渴一號(hào)方對(duì)糖尿病腎病模型大鼠NF-κB和TNF-α影響的實(shí)驗(yàn)研究

史銳 馬賢德

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847

目的初步探究自擬消渴一號(hào)方對(duì)糖尿病腎病模型大鼠腎臟保護(hù)作用的免疫炎癥反應(yīng)抑制機(jī)制。方法在2011年9月—2012年9月的實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中，將45只SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組15只：空白對(duì)照組（A）、中藥組（B）、模型組（C）。A組不予任何處理，正常飼養(yǎng)，B、C兩組采用高糖高脂飲食聯(lián)合單側(cè)腎切除加小劑量STZ方法復(fù)制糖尿病腎病大鼠模型成功后，分別給予自擬消渴一號(hào)方和等量生理鹽水灌胃治療，連續(xù)治療4周后，檢測(cè)各組大鼠腎臟組織中NF-κB和TNF-α的變化。與空白對(duì)照組比較，DN模型組大鼠腎臟組織中NF-κB蛋白表達(dá)及TNF-α含量顯著上調(diào)（P＜0.01），而自擬消渴一號(hào)方能夠有效下調(diào)二者的表達(dá)，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論自擬消渴一號(hào)方對(duì)糖尿病腎病模型大鼠的腎臟具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制糖尿病腎病模型大鼠的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。

糖尿病腎病；NF-κB；TNF-α

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病較為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者重要的致死原因之一。多年來(lái)，研究者一直在不斷的探索治療DN的新方法、新方藥。自擬消渴一號(hào)方是根據(jù)糖尿病早期的發(fā)病原因及DN出現(xiàn)后的癥候特征而擬定，已應(yīng)用于臨床，療效較為滿意，但具體療效機(jī)制不明。研究發(fā)現(xiàn)，免疫炎癥反應(yīng)是糖尿病腎病的重要發(fā)病環(huán)節(jié)之一，核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor-kappa B,NF-κB)、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor；TNF-α）則是參與此環(huán)節(jié)的重要細(xì)胞因子。該實(shí)驗(yàn)則以NF-κB、TNF-α為主要觀察指標(biāo)，探究消渴一號(hào)方是否能夠抑制糖尿病腎病模型大鼠的免疫炎癥反應(yīng)，為明確消渴一號(hào)方的療效機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。在2011年9月—2012年9月的實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中，將45只SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組15只：空白對(duì)照組（A）、中藥組（B）、模型組（C）?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)雄性SD大鼠45只，隨機(jī)分為4組，空白對(duì)照組（A）、中藥組（B）、模型組（C）。所有動(dòng)物購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué),許可證號(hào)為SCXK（遼）2008-0005,體重200±20 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，12小時(shí)周期節(jié)律，自由進(jìn)水進(jìn)食。

1.2 模型制備及給藥

A組不予任何處理，正常飼養(yǎng)，B、C兩組動(dòng)物給予高糖高脂飲食喂飼8周，飼料配方為常規(guī)飼料內(nèi)加20%蔗糖，10%豬油，2.5%膽固醇。然后行右側(cè)腎切除術(shù)，術(shù)后飼養(yǎng)2周；2周后再經(jīng)腹腔注射STZ，劑量為40 mg/kg。給藥后72 h尾尖采血檢測(cè)血糖，以血糖高于16.7 mmol/L為模型復(fù)制成功[1]。

造模成功后，B組給予自擬消渴一號(hào)方煎劑灌胃治療，劑量為1.2 g生藥/kg大鼠體重；C組給予等量（指體積）生理鹽水灌胃，連續(xù)治療4周。

1.3 主要儀器及試劑藥品

三諾安穩(wěn)型血糖儀及血糖檢測(cè)試紙，購(gòu)自成大方圓連鎖藥店。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠TNF-α試劑盒購(gòu)自上海越研生物科技有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma公司。中藥飲片購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。

方劑組成：黨參30 g、黃芪30、麥門冬15 g、天花粉15 g、五味子10 g、紅花15 g、葛根15 g、蟬蛻10 g、桑螵蛸15 g、肉桂10 g、鹿茸10 g、地龍10 g、地鱉蟲10 g。

1.4 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 Western-blot法檢測(cè)腎臟組織中NF-κB的表達(dá)從腎臟組織中提取總蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜。將稀釋100倍的兔抗大鼠NF-κB一抗工作液置于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗稀釋100倍后置于另一直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行免疫反應(yīng)，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育60 min。洗膜后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.4.2 ELISA法檢測(cè)腎臟組織中TNF-α的含量將各組大鼠腎臟組織以1:10比例與PBS緩沖液混合制備組織勻漿，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)腎臟組織勻漿中TNF-α的含量。

表1 各組大鼠腎臟中NF-κB表達(dá)及TNF-α含量(±s)

表1 各組大鼠腎臟中NF-κB表達(dá)及TNF-α含量(±s)

注：與模型組比較，☆表示P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別n NF-κB（積極分光密度值，比值）TNF-α（ng/L）空白對(duì)照組中藥組模型組10 10 10 FP（0.550±0.028）☆（0.721±0.063）☆1.019±0.050 233.566 0.000（38.68±5.83）☆（53.11±6.65）☆75.95±8.73 68.587 0.000

圖1 各組大鼠腎臟組織中NF-κB蛋白的表達(dá)

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用spss10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 糖尿病腎病大鼠模型復(fù)制成功

該實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂飲食+手術(shù)+STZ法復(fù)制糖尿病腎病大鼠模型，造模后尾尖采血檢測(cè)大鼠血糖，血糖均高于16.7 mmol/L，模型復(fù)制成功。

2.2 NF-κB蛋白表達(dá)及TNF-α含量檢測(cè)

與空白對(duì)照組比較，DN模型組大鼠腎臟組織中NF-κB蛋白表達(dá)及TNF-α含量顯著上調(diào)（P＜0.01），而自擬消渴一號(hào)方能夠有效下調(diào)二者的表達(dá)，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。各組大鼠NF-κB表達(dá)及TNF-α含量詳見(jiàn)表1、圖1。

3 討論

糖尿病,屬于中醫(yī)“消渴”范疇,而DN屬于中醫(yī)“腎勞”范疇,我們根據(jù)糖尿病早期的發(fā)病原因及DN出現(xiàn)后的癥候特征擬定出自擬消渴一號(hào)方，對(duì)早期糖尿病腎病進(jìn)行防治，已應(yīng)用于臨床，療效較為滿意。但治療機(jī)理不明。

腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor；TNF-α），是體內(nèi)的重要炎性因子，在腎臟中很多細(xì)胞均可產(chǎn)生TNF-α。多種因素也可刺激TNF-α的合成及分泌，如：DN模型大鼠的高糖狀態(tài)；體內(nèi)因氧化劑產(chǎn)生過(guò)多而處于氧化應(yīng)激狀態(tài)；各種細(xì)胞因子分泌的失衡狀態(tài)，都可以刺激機(jī)體產(chǎn)生TNF-α。TNF-α在體內(nèi)發(fā)揮著各種生物學(xué)作用，除了殺傷腫瘤細(xì)胞外，免疫損傷作用尤為重要，并且免疫損傷的程度與TNF-α的含量成正比[2]。該研究中選用的自擬消渴方可以有效抑制TNF-α的表達(dá)，從而減輕了DN模型大鼠體內(nèi)蓄積過(guò)量的TNF-α對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的免疫損傷。這可能是自擬消渴一號(hào)方對(duì)DN模型大鼠治療作用的機(jī)理之一。

核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor-kappa B,NF-κB)是一種分布和作用均十分廣泛的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB是多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn),可雙向調(diào)控一系列基因的表達(dá),這些基因的表達(dá)產(chǎn)物在炎癥和自身免疫等反應(yīng)中起重要作用。同時(shí)，NF-κB是一種多向因子，不僅具有抑制細(xì)胞凋亡作用，還有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，不同的條件及刺激下體現(xiàn)出促凋亡和抗凋亡的雙重特性[3-4]。該研究結(jié)果表明，NF-κB在DN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著促凋亡作用，與空白對(duì)照組比較，模型組DN模型組大鼠腎臟組織中NF-κB蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），而經(jīng)過(guò)自擬消渴一號(hào)方治療后，NF-κB蛋白的表達(dá)得到了很好的控制。因此，我們推測(cè)這可能是自擬消渴一號(hào)方對(duì)DN模型大鼠治療作用的又一機(jī)理。

當(dāng)然，模型的成功制備為本實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了重要保障。我們前期的研究結(jié)果表明，高糖高脂+手術(shù)+STZ法復(fù)制糖尿病腎病模型具有成模率高，成模時(shí)間短，病理改變與臨床貼近等優(yōu)點(diǎn)。此方法復(fù)制的糖尿病腎病模型大鼠的血脂，血糖，血胰島素，24 h尿蛋白均明顯高于空白對(duì)照組。因此，該實(shí)驗(yàn)采用此方法進(jìn)行糖尿病腎病大鼠模型的制備。

另外，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TNF-α能夠刺激NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，而NF-κB被激活后又反過(guò)來(lái)影響TNF-α的表達(dá)。故自擬消渴一號(hào)方很有可能還具有抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，這將有待于進(jìn)一步研究。

[1]徐穎,周世文,湯建林.實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠模型建立及優(yōu)化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(22):2248-2249.

[2]熊盈.TNFα、NFκB誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及雷帕霉素干預(yù)影響[D].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，2010.

[3]肖樺，楊秋萍，趙燕，等.燈盞花素對(duì)糖尿病大鼠腎組織NF-κB和腎功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].陜西中醫(yī)，2008，29（5）:624-626.

[4]秦貴軍，岳欣閣，張賀，等.糖尿病大鼠腎小球IL-18、ICAM-1和TNF-α表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)糖尿病雜志，2008，16（9）：541-543

R587.1

A

1672-4062（2014）07（b）－0024-02

2014-04-20）

史銳（1979-），男，遼寧本溪人，碩士，副教授，從事化學(xué)教學(xué)與藥物研發(fā)工作。