王 琳 邢育鋼 李繼昌 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 150030

本實(shí)驗(yàn)對(duì)豬流行性腹瀉病毒疫苗株在Vero 細(xì)胞中的增殖規(guī)律進(jìn)行了進(jìn)一步探索，以獲得該疫苗株增殖的最佳條件，從而為豬流行性腹瀉病毒細(xì)胞疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

（1）毒株。豬流行性腹瀉病毒疫苗株（CV777）由本單位提供。病毒粒子濃度為5×108PFU/mL。

（2）主要試劑。DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司，進(jìn)口胎牛血清購(gòu)自Hyc1one，胰酶購(gòu)自Washington公司。

（3）細(xì)胞及傳代培養(yǎng)。Vero 細(xì)胞來(lái)自哈爾濱獸醫(yī)研究所，在本實(shí)驗(yàn)室已擴(kuò)增凍存，目前在本實(shí)驗(yàn)室傳至130 代，已經(jīng)適應(yīng)在本實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。滿瓶的Vero 細(xì)胞用0.25%胰酶-EDTA 消化脫壁后，用10%DMEM 培養(yǎng)基（含10%進(jìn)口胎牛血清）終止消化并稀釋到2～3×105個(gè)/mL，在10L 轉(zhuǎn)瓶（內(nèi)壁表面積約為4000cm2)中加入培養(yǎng)基1000mL，細(xì)胞重新貼壁以后密度約為5～6×104個(gè)/cm2，在37℃恒溫中，轉(zhuǎn)瓶機(jī)釆用12 轉(zhuǎn)/h 培養(yǎng)72h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層以后密度約為4×105個(gè)/cm2，用于接毒或傳代。

（4）PEDV 在六孔板培養(yǎng)體系中的繁殖試驗(yàn)。取長(zhǎng)滿Vero 細(xì)胞的六孔板（每孔直徑為3.5cm，表面積為9.5cm2)兩塊（做兩組平行對(duì)照，分別標(biāo)記為NC1 組、NC2 組），每孔細(xì)胞密度約為4×105個(gè)/cm2，棄去培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液洗滌三次，以去除殘留培養(yǎng)基。每孔加入200μL 病毒液，5%CO2培養(yǎng)箱中37°C 吸附1h，棄去病毒液，補(bǔ)加維持液（不含血清的DMEM 培養(yǎng)基）2mL，胰酶濃度為5μg/mL，每板留一孔不接毒只更換維持液作為空白對(duì)照，接毒后置于5%CO2培養(yǎng)箱中37°C 進(jìn)行培養(yǎng)，每隔12h 觀察細(xì)胞病變情況，同時(shí)收取每孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000 rpm 離心5min 后放入-20°C 保存，至接毒后72h。最后收取空白對(duì)照孔細(xì)胞培養(yǎng)上清，上清樣凍融后，按照Reed-Muench 法計(jì)算TCID／0.1mL。

TPCK 胰酶濃度對(duì)病毒在Vero 細(xì)胞中增殖的影響。按照1.4 步驟中摸索的初步條件，分別在接毒后加入TPCK-胰酶終濃度為1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、7.5μg /mL、10μg /mL 和不加胰酶6 組接毒試驗(yàn)，每組做2 組平行。比較各組結(jié)果，以確定TPCK-胰酶對(duì)病毒在Vero 細(xì)胞中增殖的最佳濃度。

接毒量對(duì)病毒在Vero 細(xì)胞中增殖的影響。在最佳TPCK 胰酶濃度條件下，分為4 個(gè)不同接毒劑量組，分別病毒粒子濃度為5×108PFU/mL 的病毒，MOI 分別為1、0.1、0.01、0.001 每個(gè)接毒劑量設(shè)置2個(gè)平行對(duì)照組，設(shè)1 組只更換維持液無(wú)病毒的空白對(duì)照，比較各組結(jié)果，以確定最佳接毒劑量。

（5）PEDV 在10L 轉(zhuǎn)瓶中增殖試驗(yàn)。根據(jù)在6孔板中探索的最優(yōu)條件，接毒后10L 轉(zhuǎn)瓶的維持液體積為1000mL。共接毒3 個(gè)10L 轉(zhuǎn)瓶，接毒后每隔12h 收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000rpm 離心5min 后放入-25℃保存，直至接毒后72h，上清樣品凍融后，按照按Reed-Muench 法計(jì)算TCID／0.1mL。

2 結(jié)果

2.1 六孔板病毒增殖試驗(yàn)結(jié)果

（1）細(xì)胞病變情況。接毒后每隔12h 觀察細(xì)胞病變，發(fā)現(xiàn)接毒后18h 少數(shù)細(xì)胞病變，24h 后細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，細(xì)胞腫脹變圓，折光性增加，顆粒物質(zhì)增多，培養(yǎng)后期出現(xiàn)細(xì)胞脫落。

圖1 接毒前后Vero 細(xì)胞的形態(tài)觀察

（2）六孔板中病毒增殖試驗(yàn)結(jié)果。接毒后采取的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行毒價(jià)檢測(cè)，結(jié)果見表1。在接毒后60h 病毒增殖滴度達(dá)到峰值1×106.3TCID50/0.1mL，空白對(duì)照無(wú)病變。峰值可維持12h、72h 以后病毒效價(jià)略有下降。

表1 六孔板屮接毒Vero 細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)病毒滴度（TCID50/ 0.1mL)

（3）接毒量對(duì)病毒在Vero 細(xì)胞中增殖的影響結(jié)果。對(duì)保存的10L 轉(zhuǎn)瓶中Vero 細(xì)胞接毒樣品進(jìn)行TCID50 檢測(cè)，空白對(duì)照組無(wú)病變，其余各組檢測(cè)結(jié)果見圖2。接毒量MOI 為0.1、1 時(shí)病毒均能獲得較好的增殖，病毒效價(jià)峰值均可以達(dá)到1×106.5TCID50/0.1mL，而當(dāng)接毒量小于0.1 時(shí)，病毒的感染量較低，效價(jià)上升速度慢，最終未能達(dá)到峰值。

圖2 不同接毒量對(duì)病毒在Vero 細(xì)胞中增殖結(jié)果

（4）胰酶濃度對(duì)病毒在Vero 細(xì)胞中増殖影響的結(jié)果。對(duì)加入不同濃度胰酶條件下病毒增殖檢測(cè)結(jié)果見圖3。當(dāng)胰酶濃度低于5μg/mL，病毒增殖速度明顯減慢，毒價(jià)未能達(dá)到峰值，當(dāng)胰酶濃度為7.5μg/mL 時(shí)，病毒增殖較穩(wěn)定，毒價(jià)能達(dá)到峰值。當(dāng)胰酶濃度達(dá)到10μg/mL 時(shí)，細(xì)胞很快在3～4h 內(nèi)被胰酶消化脫落，因此病毒無(wú)法增殖，表明該疫苗株在Vero 細(xì)胞中增值的最佳胰酶濃度為7.5μg/mL。

圖3 不同濃度胰酶條件下病毒增殖的TCID50 檢測(cè)結(jié)果

2.2 PEDV 在10L 轉(zhuǎn)瓶中增殖試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)3 個(gè)10L 轉(zhuǎn)瓶中Vero 細(xì)胞的接毒試驗(yàn)樣品進(jìn)行病毒效價(jià)檢測(cè)，結(jié)果見圖4。接毒后12h 即可檢測(cè)到病毒效價(jià)，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升，在60h 能達(dá)到最高，且峰值可以維持到72h,之后開始下降。

圖4 PEDV 在10L 轉(zhuǎn)瓶中增殖試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)PEDV 疫苗株在6 孔板和10 L 轉(zhuǎn)瓶大規(guī)模增殖的條件進(jìn)行了研究，在比較試驗(yàn)結(jié)果后確定胰酶終濃度為7.5μg／mL 作為該疫苗株大規(guī)模增殖的最佳濃度；最佳接毒劑量選擇MOI=1，在此條件下病毒增殖最高毒價(jià)均可以達(dá)到106.0/0.1mL 以上，充分說(shuō)明該疫苗株具有高度適應(yīng)在Vero 細(xì)胞大規(guī)模增殖的特性，為該疫苗株應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)提供了依據(jù)。

本試驗(yàn)在確定最佳胰酶終濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)，該疫苗株在Vero 細(xì)胞大規(guī)模增殖過程中，胰酶的加入是必不可少的。同時(shí)在對(duì)加入不同胰酶濃度進(jìn)行比較中發(fā)現(xiàn)，在濃度為5～7.5μg／mL 范圍內(nèi)病毒增殖速度隨胰酶濃度的增加上升。這是因?yàn)镻EDV毒株不同而引起對(duì)胰酶的敏感性有所差異。另外不同代次Vero 細(xì)胞對(duì)病毒增殖的敏感性不同也是引起病毒增殖對(duì)胰酶依賴性不同的重要因素。

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