單少杰，李 翔，郭紅梅，陳 宏

（天津師范大學a.生命科學學院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

苦瓜（Momordica Charantia L.）系葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬（Momordica）攀緣性草本植物.多種古籍記載，苦瓜葉片具有治療胃痛、痢疾、療瘡腫毒和驅蟲等功效[1].近年來，有文獻報道苦瓜果實提取物具有良好的廣譜抗菌功效，對革蘭氏陽性球菌（如金黃色葡萄球菌）、革蘭氏陽性桿菌（如枯草桿菌）和革蘭氏陰性桿菌（如大腸桿菌）等具有明顯的抑菌效果[2-4].苦瓜葉片作為果實以外的副產物，雖然無法食用，但其提取物能夠有效抑制某些農業(yè)害蟲，如小菜蛾、斜紋夜蛾、美洲斑潛蠅等[5-7]，因此可以作為綠色環(huán)保的害蟲抑制劑應用到農業(yè)生產中.目前研究多針對苦瓜葉片提取物對農業(yè)害蟲的抑制作用，對菌類抑制作用的報道較少.

農桿菌（Agrobacterium）是一類普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細菌，生活在植物根表面，依靠由根組織滲透出來的營養(yǎng)物質生存.農桿菌吸附在植物根部后，將自身DNA導入到植物根部，被侵染的植物會出現(xiàn)根部膨大、生長緩慢、矮小等癥狀.

本研究以無水乙醇為萃取液，制備苦瓜葉片提取液并處理農桿菌，觀測其生長情況.目的是為進一步研究苦瓜葉片的抗菌機制提供參考，也為其開發(fā)利用提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試菌種與植物

菌種：農桿菌，天津師范大學生命科學學院欒維江教授實驗室提供.

植物：苦瓜（長豐三號），由天津市農業(yè)科學院蔬菜研究所提供種子，在天津市西青區(qū)精武鎮(zhèn)種植.采收葉片，用去離子水洗凈，真空干燥后保存?zhèn)溆?

1.2 實驗方法

1.2.1 苦瓜葉片乙醇提取液的制備

具體制備方法參照文獻[5].

1.2.2 液態(tài)培養(yǎng)基的制備

取250mL雙蒸水，加入蛋白胨2.5g，酵母粉1.25g，氯化鈉2.5g，以氫氧化鈉調節(jié)pH至7.0，加熱滅菌后，每4mL為1份，分裝至試管中.每份加入4μL利福平抗生素，將制備好的液態(tài)培養(yǎng)基混勻，備用.

1.2.3 實驗處理

將苦瓜葉片提取液設置4種質量濃度（3.1、6.3、12.5、25.0g/L），同時用清水（CK1）和乙醇（CK2）作為對照，共設6個處理，每個處理重復3次.分別在各處理組中加入制備好的液態(tài)培養(yǎng)基1份，同時接種農桿菌，將各處理菌液置于28℃、200r/min環(huán)境下培養(yǎng).對菌液每12h進行1次吸光度值D（λ）600的測量.因苦瓜葉片乙醇提取液本身為綠色，為消除提取液自身顏色對吸光度的影響，另配制每個濃度下未接種農桿菌的培養(yǎng)基，測量吸光度值.最終測量值為含菌培養(yǎng)液的吸光度值減去不含菌培養(yǎng)液的吸光度值.

1.3 數(shù)據(jù)處理

以SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理和方差分析.

2 結果與分析

根據(jù)在600nm處測得的培養(yǎng)基吸光度值的變化，可以看出不同處理濃度和不同時間農桿菌的生長情況，結果如表1所示.

表1 農桿菌培養(yǎng)液在不同時間的D（λ）600Tab.1 D（λ）600of cultivation liquid of Agrobacterium at different time

由表1可以看出，CK1和CK2處理組D（λ）600相近，都顯著高于苦瓜葉片乙醇提取液中的D（λ）600.隨著提取液濃度的增大，農桿菌培養(yǎng)液的D（λ）600呈下降趨勢，但在6.3、12.5和25.0g/L 3個處理濃度下，培養(yǎng)液D（λ）600的差異沒有統(tǒng)計學意義.

為了更清晰地分析苦瓜葉片提取液對農桿菌生長的影響，作生長曲線如圖1所示.

圖1 農桿菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of Agrobacterium

從處理濃度上來看，在4個時間段中，苦瓜葉提取物質量濃度為3.1g/L的處理組與其余各處理組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義（p≤0.05）.由圖1可以看出，在處理12h時，質量濃度為3.1g/L的處理組與6.3、12.5、25.0g/L處理組之間就開始出現(xiàn)差異，同對照組相比，此時農桿菌的生長已受到抑制，證明該濃度即為抑制農桿菌生長的有效濃度.隨著處理時間的延長，D（λ）600均逐漸增大，表明培養(yǎng)液中農桿菌數(shù)量逐漸增多.4個苦瓜葉提取物處理組的吸光度值均顯著低于2個對照組，表明苦瓜葉提取物對農桿菌具有抑制作用.其中質量濃度為3.1g/L處理組的農桿菌生長曲線同其他處理組始終差別較大，而且隨著作用時間的延長，差別也逐漸增大.其余3種濃度下農桿菌的生長曲線基本重合，由此可見，這3種濃度的苦瓜葉提取物對農桿菌的抑制效果近似.

從作用時間來看，對照組、質量濃度為3.1g/L處理組在4個時間段的菌液濃度始終呈上升趨勢；質量濃度為6.3、12.5、25.0g/L的處理組在36h之前為農桿菌的快速生長期，36h和48h之間菌液濃度達到最大，這說明處理時間達到36h后，農桿菌數(shù)量趨于穩(wěn)定.

由此表明，4個苦瓜葉提取物處理組中，質量濃度為3.1g/L的提取物開始對農桿菌產生顯著的抑制效果，但抑菌能力出現(xiàn)大幅度變化的臨界質量濃度為6.3 g/L，濃度再增大時，抑菌效果已沒有顯著提升.

3 結論

本研究表明，苦瓜葉片提取液確實可以有效抑制農桿菌的生長.在4個處理濃度中，以6.3 g/L為抑制農桿菌生長的最適處理濃度.在4個時間段中，以24h為最佳的處理時間.

[1] 李承祜.藥用植物學[M].上海：科學出版社，1949.

[2] 張緒忠.苦瓜抗菌作用的研究[J].中草藥，1995，26（10）：556-559.

[3]張瑞其，馬廉蘭，呂軍華.苦瓜葉的抑菌試驗[J].贛南醫(yī)學院學報，2003，23（3）：272-273.

[4]王杰，張名位，劉興華.苦瓜提取物的抑菌作用及其穩(wěn)定性研究[J].食品科技，2004（4）：56-58.

[5] 郭紅梅，陳波，陳宏，等.苦瓜葉片正丁醇萃取液對小菜蛾取食及生理特性的影響[J].天津師范大學學報：自然科學版，2013，33（1）：82-84.

[6] 駱穎，張茂新，凌冰.苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對斜紋夜蛾消化酶活性的影響[J].環(huán)境昆蟲學報，2012，34（3）：289-294.

[7] 凌冰，向亞林，張茂新，等.苦瓜葉提取物對美洲斑潛蠅取食和產卵行為的抑制作用[J].應用生態(tài)學報，2009，20（4）：836-842.