申 奧，蘇余燕，宋遠(yuǎn)麗，欒維江

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

在水稻株型指標(biāo)中，葉片的形態(tài)，特別是上位3片功能葉的形態(tài)直接影響群體的葉面積指數(shù)和受光效率，從而影響產(chǎn)量.早在20世紀(jì)70年代，松島省三等[1]就提出了“理想稻”概念，其中重要的一點(diǎn)即為葉片直立，眾多的株型研究也反復(fù)論證了葉片直立（較小的葉基角）的重要性[2].能夠影響葉片直立的重要因素之一就是葉片的卷曲度，在葉片卷曲的水稻中，上位3片葉在開花期挺直，葉基角減小，便于葉片正反面受光以及減少對植株下部的遮光，提高了群體中下層葉片的光合作用[3].葉片適度卷曲之后還可以適當(dāng)增加水稻的播插密度，在確保通風(fēng)度的條件下，獲得最佳的葉面積指數(shù)，通風(fēng)度可以影響植株的抗病性.由于水稻葉片卷曲在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中的重要作用，因此科學(xué)工作者密切關(guān)注卷葉性狀[4-5]，希望能利用這一性狀改良水稻品種.

葉片卷曲是植物應(yīng)對自然界中逆境刺激的一種反應(yīng)，由葉片細(xì)胞膨壓降低所引起，是內(nèi)部水勢狀況和滲透調(diào)節(jié)結(jié)果的外部形態(tài)表現(xiàn)[6].環(huán)境因素方面，干旱脅迫是造成植物葉片卷曲的主要因素，植物通過葉片卷曲，改變?nèi)~片的電導(dǎo)率和有效葉面積，減少其攔截的輻射量，從而降低蒸騰作用，有效防止水分損失[7].另外，Price等[8]研究認(rèn)為葉片內(nèi)泡狀細(xì)胞的腫脹減弱也可能引起葉片卷曲.

水稻中存在豐富的可穩(wěn)定遺傳的卷葉種質(zhì)資源.如Khush等[9]發(fā)現(xiàn)了6個水稻卷葉突變體，其中，rl1、rl2、rl3 突變體內(nèi)卷成圓柱狀，而 rl4、rl5、rl6（t）突變體內(nèi)卷成半圓柱狀，這6個基因分別定位在水稻1、4、12、1、3 和 7號染色體上.近年來，由于不同突變體庫的創(chuàng)建，又獲得了一些水稻卷葉突變體資源.如沈革志等[10]利用T-DNA插入法獲得了1個葉片向近軸面卷曲的突變體Rl-A2，遺傳分析表明該突變體受1個顯性單基因控制；Zhang等[11]用EMS誘變處理獲得卷葉突變體sll1，并把該基因定位在水稻第9號染色體的長臂.有些卷葉突變體的性狀在不同發(fā)育時期有所變化，如Luo等[12]發(fā)現(xiàn)了1個卷葉突變體在苗期葉片卷曲為圓柱狀，而到抽穗期則變?yōu)槲⒕頎顟B(tài)，遺傳分析表明其受1個隱性基因控制.有些卷葉突變體僅向單側(cè)卷曲，如余東等[13]用γ射線誘變方法獲得1個葉片近軸面單側(cè)右向卷曲突變體url1（t），并把該突變體基因定位在水稻1號染色體上.叢云飛等[14]用化學(xué)誘變方法獲得1個單側(cè)葉片向近軸面卷曲的突變體url2（t）.最近，王德仲等[15]從EMS突變體庫中發(fā)現(xiàn)1個水稻多突變性狀卷葉突變體nrl2（t），該突變體葉片細(xì)長且卷曲，莖桿細(xì)，并且突變體早抽穗，遺傳分析表明該突變體受1對隱性基因控制，并將該基因定位于水稻第3染色體上.另外，關(guān)于水稻葉片卷曲的分子機(jī)理，近年來也有一些研究[16-17].

該文對水稻Ac/Ds轉(zhuǎn)座子插入突變體庫中的2個葉片反向卷曲突變體的表型及組織形態(tài)進(jìn)行了研究，以此揭示水稻葉片卷曲的形態(tài)建成.

1 材料與方法

1.1 材料

野生型日本晴（Oryza sativa L.ssp.Japonica cv.Nipponbare），用WT表示；外卷突變體是葉片向葉遠(yuǎn)軸面（abaxial axis），即背向莖的一面卷曲的突變體，用Ab-M表示；內(nèi)卷突變體是葉片向葉近軸面（adaxial axis），即面向莖的一面卷曲的突變體，用Ad-M表示.內(nèi)卷和外卷突變體均來源于水稻Ac/Ds轉(zhuǎn)座子插入突變體庫，所有材料種植于天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院水稻研究所試驗(yàn)田.

1.2 石蠟切片

取野生型及內(nèi)卷和外卷突變體處于相同生長時期植株的新鮮、健壯劍葉，用刀片切成小段后，首先經(jīng)FAA固定液固定2h以上，用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精水溶液浸洗1～2次后，用梯度濃度酒精逐級脫水.之后，用梯度濃度的二甲苯酒精溶液進(jìn)一步透明處理直至材料透明，完成后將其進(jìn)行浸蠟和包埋，待石蠟?zāi)毯笥眯D(zhuǎn)切片機(jī)進(jìn)行切片.將切好的蠟片粘在載玻片上，展平，用甲苯胺藍(lán)對平展的蠟片進(jìn)行染色.染色完成后再將切片放入二甲苯中處理5～8min，封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察照相.

1.3 纖維素含量測定

纖維素的提取參照文獻(xiàn)［18］.取適量纖維素稱重后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67%的H2SO4，室溫混勻1h.加入預(yù)冷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的蒽酮試劑，混勻后620nm下進(jìn)行吸光度值的測定.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以p≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 卷葉突變體的表型分析

野生型和2個卷葉突變體植株的表型特征如圖1所示.

與野生型植株相比，外卷突變體植株呈半矮桿狀，株高約為野生型的3/4，如圖1（a）所示，但穗長沒有變短且略長于野生型，如圖1（d）所示；外卷突變體的全株葉片較窄且直立，葉片與莖桿間的角度較小，劍葉與倒二葉的葉寬約為野生型的3/4，如圖1（a）和（e）所示；另外，外卷突變體一個很明顯的表型是葉片向葉遠(yuǎn)軸面卷曲成半圓柱狀且葉脈呈白色，木質(zhì)化程度高，尤其主脈更為明顯，如圖1（a）和（c）所示.內(nèi)卷突變體株高約是野生型的1/2，如圖1（a）和（d）所示，全株葉片變窄，約為野生型的的1/2，但莖與葉之間的角度增大，呈散開狀，如圖1（a）和（e）所示；內(nèi)卷突變體葉片最明顯的特點(diǎn)是葉片向葉近軸面卷曲成半圓柱狀，同外卷突變體相比卷曲程度更大，基本接近圓柱狀，如圖 1（a）和（b）所示.與外卷突變體相比，除了葉片卷曲的方向和程度不一樣外，其花器官畸形，因此結(jié)實(shí)率和穗長大大下降，如圖 1（a）和（d）所示.

圖1 野生型和2個卷葉突變體的表型Fig.1 Phenotype of wild type and 2rolled leaf mutants

2.2 卷葉突變體葉片組織結(jié)構(gòu)的變化

水稻的野生型和2個卷葉突變體葉片的維管束如圖2所示.

水稻葉片的中脈結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，由多個維管束和一些薄壁組織組成，大維管束與小維管束相間而生，中間由薄壁組織分隔.葉片主脈中央部分有大的分隔開的通氣腔.在野生型的平展型葉片和外卷突變體葉片中，主脈中薄壁組織較多，薄壁細(xì)胞多而密，排列緊實(shí)（圖2A、B），而薄壁細(xì)胞崩裂分隔形成的2個通氣腔面積較??；在內(nèi)卷突變體葉片中，薄壁細(xì)胞少，排列較為松散，薄壁細(xì)胞崩裂分隔形成的通氣腔所占面積較大（圖2C）.水稻葉片主脈兩側(cè)有對稱分布的次脈，在野生型平展葉片中維管束較大，并伴有較多的薄壁細(xì)胞（圖2D）；外卷突變體葉片次脈的維管束略小于野生型，也伴有較多的薄壁細(xì)胞（圖2E）；而在內(nèi)卷突變體葉片次脈中維管束較小，薄壁細(xì)胞的數(shù)量也很少（圖2F）.

圖2 野生型及卷葉突變體葉片的顯微結(jié)構(gòu)Fig.2 Microstructure of leaflet of wild type and rolled leaf mutants

一般情況下，泡狀細(xì)胞在失水或缺水脅迫下會因失去膨壓而收縮進(jìn)而導(dǎo)致葉片卷曲，解除失水或缺水脅迫后，葉片又恢復(fù)原狀，這屬于不可遺傳的葉片卷曲性狀.本實(shí)驗(yàn)中的葉片卷曲是由基因突變造成的，不受環(huán)境影響.對野生型及2個卷葉突變體泡狀細(xì)胞的數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，野生型葉片中泡狀細(xì)胞數(shù)目平均為6個（圖2G）；內(nèi)卷突變體和外卷突變體葉片中平均為4個（圖2H、I）.這一結(jié)果說明2個卷葉突變體葉片的卷曲與泡狀細(xì)胞數(shù)目的減少有密切關(guān)系.

2.3 野生型與2個卷葉突變體葉片纖維素含量的比較

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組成成分，與細(xì)胞壁的構(gòu)建密切相關(guān).本文就野生型和2個卷葉突變體植株的葉片及莖中的纖維素含量進(jìn)行分析.結(jié)果表明，野生型與外卷突變體植株的葉片和莖中的纖維素含量沒有顯著差異，而內(nèi)卷突變體葉片及莖中的纖維素含量顯著減少，如圖3所示.這些結(jié)果說明內(nèi)卷突變體和外卷突變體可能由不同的基因控制.

圖3 野生型與突變體的纖維素含量Fig.3 Cellulose content of wild type and 2mutants

2.4 卷葉突變體的遺傳學(xué)分析

為了揭示卷葉突變體的遺傳規(guī)律，分別以這2個卷葉突變體為母本與野生型配制雜交組合.F1植株均表現(xiàn)出野生型性狀，收取F1植株種子播種，在F2代中均出現(xiàn)了性狀分離，分離出了預(yù)期的突變表型的植株，說明2個卷葉突變體均可以穩(wěn)定遺傳，并且是由隱性基因控制的.統(tǒng)計(jì)F2群體中突變體與野生型植株的個數(shù)，結(jié)果如表1所示.外卷突變體F2中，31株F2單株中有5株表現(xiàn)為突變體性狀，χ2（3∶1）檢驗(yàn)表明該卷葉性狀符合3∶1分離；內(nèi)卷突變體F2中，53株F2單株中有14株表現(xiàn)突變體性狀，χ2（3∶1）檢驗(yàn)表明該卷葉性狀也符合3∶1分離.這些結(jié)果說明2個卷葉突變體的性狀均由隱性單基因控制.

表1 2個卷葉突變性狀的遺傳規(guī)律分析Tab.1 Genetic analysis of 2rolled leaf mutants

3 討論

水稻中葉片的適度卷曲有利于改善水稻基部的受光條件，提高植株的光能利用率；但葉片過度卷曲會產(chǎn)生許多不利影響，如有效葉面積指數(shù)較小、光合有效輻射和有效利用率偏低等.本研究通過對2種卷葉突變體的表型分析，發(fā)現(xiàn)二者在表型及細(xì)胞學(xué)結(jié)構(gòu)上存在一定差異，與野生型相比，突變體葉片中泡狀細(xì)胞的數(shù)量也發(fā)生了變化.王曉等[19]通過對1個DS轉(zhuǎn)座子插入的卷葉突變體進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)其泡狀細(xì)胞數(shù)目與野生型相比有明顯差異；Zhang等[11]對sll1突變體的研究也證實(shí)了葉片的卷曲與泡狀細(xì)胞的數(shù)目有關(guān).

目前，在水稻中已經(jīng)鑒別并克隆出一系列卷葉基因，絕大多數(shù)是由隱性單基因控制的，也有研究發(fā)現(xiàn)了部分不受隱性單基因控制的基因[20-21].本文配制的F2分離群體可能由于秈粳雜交育性受到影響，獲得的F2種子數(shù)量較少，但遺傳分析發(fā)現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)群體中二者的突變性狀都符合3∶1的分離比，這表明2個卷葉突變體都由隱性單基因控制.目前課題組已經(jīng)定位并克隆了內(nèi)卷突變體的基因，發(fā)現(xiàn)其編碼1個細(xì)胞壁纖維素合成酶（另文發(fā)表）.結(jié)合2.3結(jié)果，說明內(nèi)卷突變體由于纖維素合成酶基因的突變造成了合成途徑受阻，從而造成纖維素含量減少.但外卷突變體的纖維素含量正常，說明外卷突變體與內(nèi)卷突變體可能由不同基因控制.課題組已經(jīng)擴(kuò)大了外卷突變體的F2群體，并通過基因定位進(jìn)一步克隆控制葉片外卷的基因，以揭示葉片不同方向卷曲的分子機(jī)理.

植物葉片的發(fā)育包括葉原基的形成和葉極性的建立，后者對葉的形態(tài)有重要影響[22].近年來在擬南芥（Arabidop sithaliana）和金魚草（Antirrhinum majus）中研究發(fā)現(xiàn)，控制葉片近軸-遠(yuǎn)軸發(fā)育的基因發(fā)生突變會引起葉片卷曲，如 PHAN[23]，YABBY[24]、KANADI基因[25]和HD-ZIPⅢ基因家族中的 PHB、PHV、REV、ATHB15[26].玉米顯性突變體kn1（knotted1）基因造成葉片發(fā)育的基-頂軸破壞，植株葉鞘組織沿側(cè)生葉脈向上伸出進(jìn)入葉片，從而使葉基部的表皮和葉肉細(xì)胞具有葉鞘的特點(diǎn)[27].在水稻中，已經(jīng)克隆得到的RL9基因可以編碼GARP結(jié)構(gòu)域蛋白，并且與擬南芥中的KANADI基因是同源基因[28].Luo等[12]預(yù)測的在秈稻Ⅱ-32B中的動態(tài)卷葉突變體基因是一個編碼類似Myb的轉(zhuǎn)錄因子，與擬南芥中的KANADI基因同源[15].此外，研究發(fā)現(xiàn)植物葉片的發(fā)育還與生長素有關(guān)，在擬南芥和矮牽牛（Petunia hybrida）中發(fā)現(xiàn)的基因YUCCA和FLOOZY的突變，會引起內(nèi)源吲哚乙酸含量變化，從而使葉片卷曲[29-30].在水稻中也發(fā)現(xiàn)了類似基因，如NAL7與YUCCA同源，編碼一種黃素單加氧酶，該基因突變會引起IAA含量的變化，導(dǎo)致葉片卷曲[31].因此葉片卷曲涉及較為復(fù)雜的生理過程及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，要精確了解葉片卷曲的分子機(jī)理，必需研究多基因相互作用及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以更好利用卷葉資源.

[1] 松島省三，楊春和.理想水稻栽培技術(shù)概要[J].北方水稻，1978（1）：43-47.

[2]SAKAGAMI Y，YOSHIDA M，ISOGAI A，et al.Peptidal sex hormones inducing conjugation tube formation in compatible mating-type cells of Tremella mesenterica[J].Science，1981，212（4502）：1525-1527.

[3] 沈年偉，錢前，張光恒.水稻卷葉性狀的研究進(jìn)展及在育種中的應(yīng)用[J].分子植物育種，2009，7（5）：852-860.

[4] 袁隆平.我國兩系法雜交水稻研究的形勢、任務(wù)和發(fā)展前景[J].農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究，1997，18（1）：1-3.

[5]陳忠祥.寧夏南部回族社區(qū)生態(tài)環(huán)境建設(shè)若干重要問題的探討[J].干旱區(qū)地理，2001，24（4）：338-341.

[6]HSIAOW L，GATTONI-CELLI S，WEINSTEIN I B.Oncogene-induced transformation of C3H 10T1/2cells is enhanced by tumor promotors[J].Science，1984，226（4674）：552-555.

[7]POMMERRENIG B，PAPINI-TERZI F S，SAUER N.Differential regulation of sorbitol and sucrose loading into the phloem of Plantago major in response to salt stress[J].Plant Physiology，2007，144（2）：1029-1038.

[8]PRICE D L，SISODIA S S，BORCHELT D R.Genetic neurodegenerative diseases：the human illness and transgenic models[J].Science，1998，282（5391）：1079-1083.

[9]KHUSH G S，KINOSHITA T.Rice karyotype，marker genes and linkage groups[C]//KHUSH G S，TORENNIESSEN G H.Rice Biotechnology.Wallingford：CAB International，1991：83-108.

[10]沈革志，王新其，殷麗青，等.T-DNA插入水稻群體中卷葉突變體R1-A2的遺傳分析[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報，2003，36（6）：459-464.

[11]ZHANG G H，XU Q，ZHU X D，et al.SHALLOT-LIKE1is a KANADI transcription factor that modulates rice leaf rolling by regulating leaf abaxial cell development[J].Plant Cell，2009，21（3）：719-735.

[12]LUO Z K，YANG Z L，ZHONG B Q，et al.Genetic analysis and fine mapping of a dynamic rolled leaf gene，RL10（t），in rice（Oryza sativa L.）[J].Genome，2007，50（9）：811-817.

[13]余東，吳海濱，楊文韜，等.水稻單側(cè)卷葉突變體B157遺傳分析及基因初步定位[J].分子植物育種，2008，6（2）：220-226.

[14]叢云飛，方立魁，趙芳明，等.水稻單側(cè)卷葉突變體url2（t）的鑒定與遺傳分析[J].西南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，32（4）：22-25.

[15]王德仲，桑賢春，游小慶，等.水稻細(xì)卷葉突變體nrl2_（t）的遺傳分析和基因定位[J].作物學(xué)報，2011，37（7）：1159-1166.

[16]XIANG J J，ZHANG G H，QIAN Q，et al.Semi-rolled leaf1encodes a putative glycosylphosphatidylinositol-anchored protein and modulates rice leaf rolling by regulating the formation of bulliform cells[J].Plant Physiology，2012，159（4）：1488-1500.

[17]FANG L，ZHAO F，CONG Y，et al.Rolling-leaf 14is a 2OG-Fe（II）oxygenase family protein that modulates rice leaf rolling by affecting secondary cell wall formation in leaves[J].Plant Biotechnol J，2012，5（10）：524-532.

[18]UPDEGRAFF D M.Semimicro determination of cellulose in biological materials[J].Ana Biochem，1969，32（3）：420-424.

[19]王曉，顧福根，孫丙耀.一個有Ds插入引起的泡狀細(xì)胞異常水稻卷葉突變體[J].蘇州大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，28（2）：89-94.

[20]李仕貴，馬玉清，何平，等．一個未知的卷葉基因的識別和定位[J]．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，16（4）：391-393.

[21]邵元健，潘存紅，陳宗祥，等.水稻不完全隱性卷葉主基因rl（t）的精細(xì)定位[J].科學(xué)通報，2005，50（19）：2107-2113.

[22]施勇烽，陳潔，劉文強(qiáng)，等.一個新的水稻卷葉突變體的遺傳分析與基因定位[J].中國科學(xué)，2009，39（4）：407-412.

[23]WAITES R，HUDSON A，PHANTASTICA.A gene required for dorsoventrality of leaves in Antirrhinum majus[J].Development，1995，121（7）：2143-2154.

[24]SIEGFRIED K R，ESHED Y，BAUM S F，et al.Members of the YABBY gene family specify abaxial cell fate in Arabidopsis[J].Development，1999，126（18）：4117-4128.

[25]KERSTETTER R A，BOLLMAN K，TAYLOR R A，et al.KANADI regulates organ polarity in Arabidopsis[J].Nature，1999，411（6838）：706-709.

[26]EMERY J F，F(xiàn)LOYD S K，ALVAREZ J，et al.Radial patterning of Arabidopsis shoots by classⅢHD-ZIP and KANADI genes[J].Current Biology，2003，13（20）：1768-1774.

[27]JACKSON D，VEIT B，HAKE S.Expression of maize KNOTTED1related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot[J].Development，1994，120（2）：405-413.

[28]YAN S，YAN C J，ZENG X H，et al.Rolled leaf 9，encoding a GARP protein，regulates the leaf abaxial cell fate in rice[J].Plant Mol Biol，2008，68（3）：239-250.

[29]ZHAO Y，CHRISTENSEN S K，F(xiàn)ANKHAUSER C，et al.A role for flavin monooxygenase-like enzymes in auxin biosynthesis[J].Science，2001，291（5502）：306-309.

[30]TOBENA-SANTAMARIA R，BLIEK M，LJUNG K，et al.FLOOZY of petunia is a flavin monooxygenase-like protein required for the specification of leaf and flower architecture[J].Genes Dev，2002，16（6）：753-763.

[31]FUJINO K，MATSUDA Y，OZAWA K，et al.Narrow leaf 7controls leaf shape mediated by auxin in rice[J].Mol Genet Genomics，2008，279（5）：499-507.