曾 錚，張亦陳，劉逸塵，郝 彤，孫金生，2

（1.天津師范大學a.生命科學學院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；2.天津市水生動物疫病預防控制中心，天津300221）

蝦蟹是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物.近年來，隨著市場需求的增加，蝦蟹養(yǎng)殖規(guī)模持續(xù)擴大，產(chǎn)業(yè)化水平也逐年提高.長期以來，蝦蟹養(yǎng)殖過程中由細菌、病毒等引起的病害十分嚴重，制約了蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)的進一步發(fā)展[1].目前，對蝦蟹的免疫器官和免疫系統(tǒng)組分仍缺乏全面系統(tǒng)的了解，這也是蝦蟹病害不能被有效預防和治療的重要原因之一.

表達序列標簽（EST）是從一個隨機的cDNA克隆進行5’端和3’端單一測序獲得的短cDNA部分序列，代表完整基因的一小部分，在數(shù)據(jù)庫中其長度一般為20～7000bp，平均長度為400bp[2].1991年Adams等[3]首次應用EST技術(shù)研究人腦基因的表達狀況，迄今為止，EST技術(shù)在了解生物的基因組成和環(huán)境脅迫特異性表達方面發(fā)揮了重要作用.近年來，蝦蟹的EST序列測定工作取得很大進展，如凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、斑節(jié)對蝦（Penaeus mondon）、中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、藍蟹（Callinectes sapidus）等蝦蟹的EST序列已被注冊到NCBI的dbEST數(shù)據(jù)庫中.這些已公布的蝦蟹EST序列為我們進一步了解蝦蟹基因在不同組織或細胞中的特異性表達和尋找免疫、繁殖、生長等基因提供了大量信息.

數(shù)據(jù)挖掘與系統(tǒng)分析是獲得大量序列結(jié)果之后面臨的主要問題.通過對海量數(shù)據(jù)的全面系統(tǒng)分析，找出目標序列，對開展深入研究至關重要.NCBI數(shù)據(jù)庫通過綜合不同實驗室的實驗檢測結(jié)果，得到了大量中國明對蝦和中華絨螯蟹的基因注釋信息.本研究在此基礎上，使用Blast2GO軟件從已公布的中國明對蝦和中華絨螯蟹EST序列中，篩選出尚未經(jīng)實驗證實的推測的免疫相關基因，并研究中華絨螯蟹免疫基因在不同細胞或組織中的分布情況.

1 材料和方法

1.1 EST序列的獲得

中國明對蝦和中華絨螯蟹的EST序列下載自GenBank的子庫dbEST.其中，中國明對蝦EST序列有10512條，中華絨螯蟹EST序列有17067條.

1.2 分析平臺和相關軟件

Blast2GO是一個基于java的集序列功能注釋和注釋數(shù)據(jù)分析為一體的工具，具有易操作、界面友好、高通量等特點[4].Perl程序Chimeric_Check.pl和PolyA_Check.pl來自文獻［2］，分別用來去除嵌合序列和檢查polyA、polyT的序列條數(shù).CAP3是序列拼接程序[5]，由 http：//seq.cs.iastate.edu/cap3.html下載得到.

1.3 對EST進行序列分析

下載得到的EST序列文件中包含在不同時間由不同實驗室提交的同一物種的不同器官、組織或細胞的所有EST.本研究認為序列號連續(xù)并注釋相同的EST為一批序列，使用程序提取出來供后續(xù)分析.在文庫構(gòu)建過程中可能會產(chǎn)生嵌合序列，中間有很長的polyA或載體序列[2]，使用Chimeric_Check.pl將嵌合序列去除.此外，若EST序列兩端存在poly A或者poly T，說明該序列表示的cDNA可能被完全測通，能夠代表完整的mRNA信息[2].使用PolyA_Check.pl查找poly A和poly T的序列，并去除序列中的poly A和poly T.使用CAP3對序列進行聚類拼接，參數(shù)選擇默認設置，得到的結(jié)果被視為Unigene.最后使用Blast2GO軟件注釋Unigene，Blasting步驟選用blastx默認設置.

1.4 篩選免疫基因

本研究通過篩選免疫相關GO注釋和檢索免疫關鍵詞2種方法尋找免疫基因.Blast2GO軟件在Annotation步驟中按照所設參數(shù)選取GO注釋，并在Analysis步驟中返回GO注釋餅圖，選擇GO注釋可被追溯至第 2層 GO術(shù)語 GO：0002376（immune system process）的所有基因為免疫基因.另外，使用免疫基因的名稱和注釋信息作為檢索關鍵詞，分析Blasting過程中blastx的注釋結(jié)果文件，提取出相關基因.關鍵詞來源于免疫相關文獻資料，包括蝦、蟹、鱟等EST分析和綜述性文章中出現(xiàn)的免疫基因注釋信息[6-10].關鍵詞有140個，涉及模式識別蛋白、蛋白酶和蛋白酶抑制劑、酚氧化酶原激活系統(tǒng)、細胞毒性活性氧等14大類.例如，一個關鍵詞“phenoloxidase”可以完成“phenoloxidase（PO）”、“prophenoloxidase（proPO）”、“prophenoloxidase activating factor（PPAE）”和“prophenoloxidase activating enzyme（PPAE）”全檢索到.為了提高檢索的準確性，研究中對整個過程進行人工核查.

2 結(jié)果與分析

2.1 EST數(shù)據(jù)分析和注釋結(jié)果

分析下載得到的EST數(shù)據(jù)顯示，中國明對蝦僅有頭胸部（cephalothorax）的EST信息，中華絨螯蟹的EST序列包括血細胞、肝胰腺（hepatopancreas）、性腺（sex gland）、精巢（testis）.其中，中華絨螯蟹血細胞的EST序列有2套，為不同時間不同實驗室提交的序列，在注釋上表現(xiàn)也不同，本研究分別使用血細胞Ⅰ（hemocyte）和血細胞Ⅱ（haemocyte）加以標識，采用同一種方法分別處理.EST序列經(jīng)CAP3軟件聚類拼接后獲得相應的Unigene，結(jié)果如表1所示.

表1 EST序列分析數(shù)目統(tǒng)計Tab.1 Statistics number of EST sequences analysis 條

由表1可知，除性腺的EST外，其余細胞或組織的EST中都發(fā)現(xiàn)了嵌合序列.其中，中國明對蝦頭胸部EST的嵌和序列數(shù)量最多，中華絨螯蟹精巢EST中嵌和序列所占比例則最高.除性腺外，其余細胞或組織的EST中都有包含polyA和polyT的EST.中國明對蝦頭胸部含有polyA的EST數(shù)目最多，所占比例也最高.經(jīng)CAP3軟件將EST聚類拼接后形成的序列為Unigene，中國明對蝦頭胸部EST拼接后獲得的Unigene最多，中華絨螯蟹中，血細胞ⅡEST拼接獲得的Unigene最多，性腺中最少.

Blast2GO注釋結(jié)果如表2所示.經(jīng)blastx比對，中國明對蝦頭胸部被注釋的Unigene數(shù)量最多，占Unigene總量的33.52%；中華絨螯蟹肝胰腺Unigene注釋的比例最高，達到53.06%；中華絨螯蟹性腺中被注釋的Unigene數(shù)量最少.

表2 Blast2Go注釋過程中各步驟注釋到的序列條數(shù)Tab.2 Number of Unigene statistic in each annotation step by Blast2Go 條

2.2 免疫基因篩選結(jié)果

通過Blast2GO統(tǒng)計第2層的生物過程GO分布，得到與第2層GO術(shù)語GO：0002376（immune system process）有關的基因，包括中國明對蝦頭胸部、中華絨螯蟹血細胞Ⅰ、肝胰腺、性腺、精巢的Unigene，結(jié)果如表3所示.

表3 免疫相關GO注釋到的基因Tab.3 Genes annotated by immune-related GO term

由于通過GO分析確定的免疫基因數(shù)量過少，因此需要進一步通過免疫關鍵詞檢索blastx比對結(jié)果來尋找免疫基因.本研究參考甲殼動物免疫系統(tǒng)的文獻和EST分析文獻[6-9]，確定了與免疫相關的關鍵詞72條，在blastx的比對結(jié)果中進行搜索，共獲得680條免疫基因.這些基因涉及模式識別蛋白、酚氧化酶原激活系統(tǒng)、蛋白酶和蛋白酶抑制劑等無脊椎動物免疫系統(tǒng)的重要組分.綜合以上2種方法篩選的免疫基因，去除其中的重復結(jié)果，最終共獲得免疫基因Unigene 680條，其中中華絨螯蟹血細胞Ⅰ發(fā)現(xiàn)的免疫基因最多.不同組織和細胞中的免疫基因在各免疫系統(tǒng)組分中的分布如表4所示，其中無法確定免疫系統(tǒng)組分的歸入“其他”類.

表4 不同細胞和組織免疫相關基因的功能分布Tab.4 Function distribution of immune-related genes from different cells and tissues 條

3 討論與結(jié)論

本研究首先通過GO注釋的提示篩選免疫基因，但數(shù)量較少.繼而通過檢索免疫關鍵詞的方法篩選，獲得了大量免疫相關基因.從另一角度來看，雖然GO注釋方法獲得的免疫基因數(shù)量不多，但得到的一些信息是關鍵詞檢索無法取代的.例如，gb|FL571594.1|是中華絨螯蟹血細胞Ⅰ的Unigene，GO注釋表明該基因參與Toll信號通路過程，而檢索免疫關鍵詞的方法并未發(fā)現(xiàn)該基因；利用這2種方法都能預測中華絨螯蟹gb|GE340553.1|是免疫基因，關鍵詞檢索僅能提示該基因是凝結(jié)蛋白，而GO注釋“hemolymph coagulation”（GO：0042381）則提供了更多的關于該基因的功能信息.除gb|GE340553.1|外，使用2種方法都能檢索到的免疫基因還包括中國明對蝦的Contig527、gb|BM297142.1|以及中華絨螯蟹血細胞Ⅰ的gb|FL571592.1|，分別為β-葡聚糖識別蛋白和toll-like受體.由此可見，GO提示信息和關鍵詞檢索方法具有互補性，二者相結(jié)合尋找免疫基因?qū)τ谕晟泼庖呋蛐畔⒑土私饷庖呦到y(tǒng)組分很有必要.

在綜合GO提示信息和關鍵詞檢索得到的免疫基因中，一部分與已報道的中國明對蝦和中華絨螯蟹的免疫基因一致，這些免疫基因的功能注釋來自NCBI數(shù)據(jù)庫.例如，在中華絨螯蟹血細胞中發(fā)現(xiàn)多種抗菌肽，包括crustin i、crustin iii、抗脂多糖因子、抗脂多糖因子2、抗脂多糖因子3和osmotin.另外，本文還通過預測獲得了一批在蝦、蟹中尚未報道的潛在免疫基因.其中，中國明對蝦頭胸部中有60個，約占總預測基因數(shù)量的40%，中華絨螯蟹中共有250個，在各組織和細胞中的分布如表5所示.中華絨螯蟹血細胞Ⅱ中，GeneBank號為FG984061.1的EST與胡椒屬（Piper colubrinum）的osmotin有79%的相似性.osmotin是一類植物抗病相關的蛋白，主要用來對抗真菌[11]，因此，中華絨螯蟹體內(nèi)的FG984061.1也可能有抗御真菌的作用.這些預測的基因與其他物種的免疫基因高度相似，因此也很可能參與了蝦、蟹體內(nèi)的免疫過程.

表5 免疫基因注釋結(jié)果在不同物種中的分布Tab.5 Distribution of immune-related genes in different organisms 個

本研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹血細胞的免疫基因數(shù)量比其他組織多，其中含有參與酚氧化酶原激活系統(tǒng)的多種因子，抗菌肽類的免疫基因種類也更豐富.中華絨螯蟹血細胞和中國明對蝦頭胸部的EST中都發(fā)現(xiàn)了多種蛋白酶和蛋白酶抑制劑，如表6所示.

表6 蛋白酶和蛋白酶抑制劑在不同組織和細胞中分布的情況Tab.6 Distribution of protease and protease inhibitor from different tissues and cells

研究表明，血細胞作為先天免疫系統(tǒng)的重要參與者包含多種蛋白酶和蛋白酶抑制劑[12]，蛋白酶及其抑制劑可以通過水解級聯(lián)反應激活啟動Toll受體、類補體反應、酚氧化酶原激活系統(tǒng)和凝集系統(tǒng)等免疫途徑，在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用.本研究發(fā)現(xiàn)蝦、蟹具有很多先天免疫系統(tǒng)的重要組分，這進一步證實了甲殼動物可依靠先天免疫系統(tǒng)抗御病原侵染，其中，血細胞是多種免疫應答的發(fā)起者，在抗病過程中發(fā)揮了重要作用.

肝胰腺是甲殼動物重要的內(nèi)分泌器官和消化器官，近年來已有一些研究提示肝胰腺可能參與免疫過程[13].Du等[14]研究螺原體MR-1008對肝胰腺中AKP、ACP、SOD、CAT等免疫基因的影響時，發(fā)現(xiàn)MR-1008能夠啟動或抑制這些基因的免疫應答，并且認為肝胰腺在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用.Jin等[15]在中華絨螯蟹中克隆出了2種C型凝集素，并且發(fā)現(xiàn)能夠在肝胰腺中表達.此外，有報道指出蝦類肝胰腺中存在多種類型的凝集素，其表達量在細菌感染前后差異顯著[16-18].本研究在中國明對蝦的頭胸部、中華絨螯蟹的血細胞和肝胰腺中都發(fā)現(xiàn)了凝集素，其中中華絨螯蟹肝胰腺EST的凝集素種類最多，包括凝集素a、凝集素b、C型凝集素1、C型凝集素2、C型凝集素3等.這有助于全面認識甲殼動物肝胰腺的功能以及正確評價其在免疫過程中的重要作用.

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