楊 宇 陳 夢(mèng) 張美琴 張宇平 呂思航

1.沈陽醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,遼寧沈陽 110034；2.沈陽醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系2011 級(jí)學(xué)生，遼寧沈陽 110034

5-羥色胺（5-HT)是下行抑制系統(tǒng)參與機(jī)體鎮(zhèn)痛作用的主要神經(jīng)性活性物質(zhì)，下行抑制系統(tǒng)是外周損害性信息向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)的重要結(jié)構(gòu)，脊髓背角層是下行抑制系統(tǒng)重要組成元件[1]。該系統(tǒng)主要由腦干中縫核簇、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)及相鄰網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成。5-HT 可密集分布在背角膠層內(nèi)，且5-HT 可通過與不同受體結(jié)合作用于不同脊角淺層傳遞傷信息性神經(jīng)元傷害中從而起到抑制神經(jīng)痛覺傳導(dǎo)的作用[2]。為此本文通過建立脊髓神經(jīng)損失大鼠模型探討內(nèi)源性下抑制易化系統(tǒng)與5-羥色胺（5-HT)對(duì)脊髓傷害感受性信息的作用機(jī)制及針刺對(duì)疼痛傳導(dǎo)的影響，旨在為臨床神經(jīng)疼痛性疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 動(dòng)物及分組

2013年1月—2013年12月選取40只Wistar 成年健康雄性大鼠（由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重為（250±10）g，晝夜節(jié)律適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫控制在（25±1）℃。隨機(jī)將大鼠分為分為正常對(duì)照組、假性手術(shù)組、模型組及針刺組，每組各10只Wistar大鼠。

1.2 模型的建立

通過分支結(jié)扎將腓總神經(jīng)和左側(cè)坐骨神經(jīng)干脛神經(jīng)切斷，將坐骨神經(jīng)剝離，保留腓總神經(jīng)建立大鼠脊髓損傷模型，術(shù)前常規(guī)禁食6～8h，術(shù)前30 min 分別肌內(nèi)注射0.5mg 阿托品（鄭州羚銳制藥股份有限公司，規(guī)格1mL：0.5mg,產(chǎn)品批號(hào)0907201,），0.01g 魯米那鈉（上海新亞藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào)040921），對(duì)照組只做麻醉處理，麻醉后靜置60 min。假手術(shù)組：麻醉后開膛后在坐骨神經(jīng)下穿線，不損傷腓總神經(jīng)和左側(cè)坐骨神經(jīng)干脛神經(jīng)。模型組：麻醉后分支結(jié)扎將腓總神經(jīng)和左側(cè)坐骨神經(jīng)干脛神經(jīng)切斷，將坐骨神經(jīng)剝離，保留腓總神經(jīng)。針刺組：針刺內(nèi)關(guān)穴5 d 后實(shí)施麻醉，操作與模型組相同。

1.3 針刺方法

根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[3]中大鼠穴位針灸方法從而擬對(duì)比人體取內(nèi)關(guān)穴（即位于大鼠橈、尺骨縫中，前臂下1/6 折點(diǎn)位置，采用醫(yī)用30 號(hào)毫針刺激內(nèi)關(guān)穴位1～2 mm，并留針1 min，共30 min，1次/d，持續(xù)針刺5 d。

1.4 Western bloting 檢測(cè)

術(shù)后1、2、3、7、14、28d 每組分別抽取健康狀況良好的5只大鼠抽取C5～T1 階段的脊髓背角和背神經(jīng)中靜脈血液5 mL，并在4℃環(huán)境中以1200r/min 的速度離心處理15 min，留取上清液。采用由美國Pierce 公司提供BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取40ug 總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉實(shí)驗(yàn)，并加入由博士德公司提供的5-HT 抗體進(jìn)行孵育震蕩過夜。次日將膜取出經(jīng)TBS 漂洗后加入美國Gell signaling 公司提供的羊抗兔二抗于室溫下孵育1h，采用ECL 發(fā)光法進(jìn)行漂洗染色。同時(shí)采用Image 1 36b 軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間均值的比較采用t 檢驗(yàn)，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD﹣t 法，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型組大鼠脊髓背角和背神經(jīng)中5-HT 蛋白于術(shù)后1、2、3、7、14、28d 顯著高于模型組假性手術(shù)組（t=3.589,3.228,3.784,3.227,3.142 和t=3.992,4.025,3.726,3.821,3.116），而針刺組大鼠脊髓背角和背神經(jīng)中5-HT 蛋白顯著下降（t=4.263,4.022,4.079,3.256,3.215 和t=4.021,4.258,3.778,3.982,3.441），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠脊髓背角和背神經(jīng)中5-HT 蛋白表達(dá)情況

3 討論

5-HT 是機(jī)體內(nèi)源性活性物質(zhì)，5-HT 不僅能參與機(jī)體免疫及炎癥反應(yīng)，同時(shí)還能參與機(jī)體中縱多病理疾病的生理過程，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)體內(nèi)免疫反應(yīng)及受損時(shí)可導(dǎo)致機(jī)體5-HT 大量釋放，并作用于效應(yīng)細(xì)胞受體中，并引起炎癥反應(yīng)[4]。此外，當(dāng)機(jī)體生理狀態(tài)出現(xiàn)改變時(shí)，機(jī)體中5-HT 也可大量釋放，并直接或間接參與機(jī)體相關(guān)調(diào)控，從而使得機(jī)體出現(xiàn)生理病理性改變。相關(guān)研究指出[5]，機(jī)體內(nèi)源下行系統(tǒng)調(diào)控完整性與5-HT 參與機(jī)體信號(hào)傳導(dǎo)具有重要的作用。劉希江[6]等認(rèn)為5-HT 可通過5-HT 受體作用于阻抗性傷害性沖動(dòng)傳導(dǎo)，并降低疼痛敏感性，從而減少疼痛對(duì)機(jī)體的傷害。本研究通過建立脊髓神經(jīng)損失大鼠模型探討內(nèi)源性下抑制易化系統(tǒng)與5-羥色胺（5-HT)對(duì)脊髓傷害感受性信息的作用機(jī)制，結(jié)果顯示模型組大鼠脊髓背角和背神經(jīng)中5-HT 蛋白（286.3±22.7）%、（178.9±14.8）%于術(shù)后2 d 顯著高于模型組假性手術(shù)組（64.3±14.2）%、（42.3±4.3）%，而針刺組大鼠脊髓背角和背神經(jīng)中5-HT 蛋白（142.3±21.3）%、（102.3±11.3）%顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，從而表明脊髓背角和背神經(jīng)中5-HT 蛋白缺失可能與脊髓神經(jīng)損傷疼痛有關(guān)，通過針刺脊髓能促使脊髓背角和背神經(jīng)中5-HT 蛋白表達(dá)，從而抑制脊髓傷害后疼痛刺激的傳導(dǎo)。

[1]劉希江,曹菲,卜慧蓮，等.脛骨癌痛大鼠脊髓背角5-羥色胺水平的變化[J].中華麻醉學(xué)雜志,2011,31(6)：695-698.

[2]甄龍,徐改玲,甄英偉，等.神經(jīng)病理性疼痛患者血清BDNF,5-HT 水平[J].神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生,2013,13(2)：154-157.

[3]王巍,邵曉丹,邵寶盛，等.“三才刺”對(duì)腎絞痛患者血漿、尿液中P 物質(zhì)、5-羥色胺水平的影響[J].針刺研究,2013,38(2)：152-157.

[4]楊娜娜,王熠釗,周寧，等.5-HT2A 和5-HT2C 受體與脊髓運(yùn)動(dòng)功能以及疼痛關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2013,35(9)：740-743.

[5]門凌,張洪欽.治偏痛膠囊治療偏頭痛的療效及對(duì)血漿5-羥色胺的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(13)：336-339.

[6]劉希江,曹菲,卜慧蓮，等.紫杉醇誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角5-羥色胺含量變化[J].臨床麻醉學(xué)雜志,2012,28(3)：262-264.