薩仁托雅，張峰，鄭有虎，盧亞楠

(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

近年來(lái)，食品安全方面的問(wèn)題越來(lái)越多，食品中某些藥物的殘留問(wèn)題受到了人們的高度重視。氯霉素可引起骨髓造血機(jī)能紊亂、視神經(jīng)炎、多發(fā)性神經(jīng)炎等癥狀，并可造成血小板減少、細(xì)胞減少性貧血［1］。呋喃唑酮會(huì)對(duì)人類(lèi)造成潛在危害，可引起溶血性貧血、眼部損害和急性肝壞死等疾病。2002年，氯霉素和硝基呋喃類(lèi)藥物被列入中國(guó)《食品動(dòng)物禁用獸藥及其他化合物清單》，規(guī)定不得在水產(chǎn)品中檢出氯霉素、硝基呋喃類(lèi)及其代謝物［2］。

目前，藥物殘留檢測(cè)技術(shù)主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［3］(GC-MS)、液相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用法［4］(LC-MS)、酶聯(lián)免疫法［5］(ELISA)、放射性免疫測(cè)定法［6-7］(RIA)等。GC-MS、LC-MS法可準(zhǔn)確定量農(nóng)藥殘留量且靈敏度高，但操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴;RIA法中標(biāo)記物易衰變且具有放射性污染;ELISA法雖操作方便快捷，但檢出限較高?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析 (CLEIA)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展較快的新型檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)集化學(xué)發(fā)光的高靈敏度和免疫分析的高特異性于一體，具有無(wú)污染、特異性強(qiáng)、檢出限低、靈敏度高等特點(diǎn)，可快速大規(guī)模篩選樣品［8-9］。本研究中，對(duì)檢測(cè)水產(chǎn)品藥物殘留的化學(xué)發(fā)光免疫分析和酶聯(lián)免疫分析兩種方法進(jìn)行了比較研究，旨在為化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

30%過(guò)氧化氫、魯米諾 (luminuol)、三羥甲基氨基甲烷 (Tris)、鹽酸 (HCl)等藥品購(gòu)于上海生工生物有限公司;呋喃唑酮代謝物 (AOZ)、氯霉素 (CAP)ELISA檢測(cè)試劑盒，以及試驗(yàn)所用抗原包被的96孔酶標(biāo)板、AOZ與CAP多克隆抗體、HRP-AOZ與HRP-CAP標(biāo)記復(fù)合物、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、洗液、標(biāo)準(zhǔn)品等均由深圳綠詩(shī)源公司提供。

Centro LB960微孔板式發(fā)光儀購(gòu)自德國(guó)Berthold公司，ELx808 Ultra Microplate Readers酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰 (Bio-tek)公司，WZ-A微量振蕩器由常州澳華儀器有限公司生產(chǎn)，恒溫水浴鍋購(gòu)于上海亞榮生化儀器廠，高速分散機(jī)ULTRATURRAX購(gòu)于IKA公司。

1.2 方法

1．2．1 藥品的配制 發(fā)光底物 A:用0．1 mol/L NaHCO3將5 mmol/L魯米諾原液稀釋成濃度為0．5 mmol/L的溶液。發(fā)光底物B:用0．1 mol/L Tris-HCl(pH 8．5)將 30%H2O2稀釋成濃度為 5 mmol/L的溶液，使用前按1∶1混合［10-11］。

1．2．2 樣品的前處理 取待測(cè)樣品可食用部分，用搗碎機(jī)搗碎后再用高速分散機(jī)勻漿。

(1)呋喃唑酮代謝物的提取。分別稱(chēng)取(1．00±0．05)g魁蚶、仿刺參、蝦夷扇貝、菲律賓蛤仔組織樣品，加入4 mL蒸餾水、0．5 mL 1 mol/L HCl和100 μL衍生化試劑，充分振蕩，56℃水浴中孵育 2 h;再加入 5 mL 0．1 mol/L K2HPO4、0．4 mL 1 mol/L NaOH和5 mL乙酸乙酯，充分振蕩5 min，室溫下以4000 r/min離心10 min;取2．5 mL上層液體加入到另一個(gè)容器中，50℃下用氮?dú)獯蹈?，加? mL正己烷溶解干燥物，再加入1 mL樣本復(fù)溶液充分混合30 s，室溫下以4000 r/min離心10 min，取50 μL下層液體進(jìn)行分析。

由于海膽中酯含量較高，不宜用乙酸乙酯提取殘留藥物，所以應(yīng)先稱(chēng)取 (1．00±0．05)g海膽樣品，加入4．5 mL甲醇和0．5 mL去離子水，振蕩2 min，以4000 r/min離心5 min，傾倒出全部液體，再加5 mL乙腈和5 mL正己烷，振蕩2 min，以4000 r/min離心5 min，傾倒出全部液體，留固體沉淀部分，再按照上述方法提取呋喃唑酮代謝物。

(2)氯霉素的提取。分別稱(chēng)取 (3．00±0．05)g魁蚶、仿刺參、蝦夷扇貝、菲律賓蛤仔組織樣品，加入3 mL去離子水混勻，再加入6 mL乙酸乙酯，振蕩2 min，室溫下以4000 r/min離心10 min;取4 mL上層液體加入到另一容器中，50℃下用氮?dú)獯蹈桑尤? mL正己烷溶解干燥物，再加入1 mL樣本復(fù)溶液混合30 s，室溫下以4000 r/min離心10 min，取50 μL下層液體進(jìn)行分析。

海膽中氯霉素的提取方法:稱(chēng)取 (3．00±0．05)g海膽樣品，加入9 mL乙腈-水 (84 mL∶16 mL)溶液振蕩2 min，室溫下以4000 r/min離心10 min;取3 mL上層相與3 mL去離子水混合，加入 4．5 mL乙酸乙酯，混合 1 min，室溫下以4000 r/min離心10 min;取上層有機(jī)相，50℃下用氮?dú)獯蹈?，再按照上述氯霉素提取方法進(jìn)行提取。

地域文學(xué)和文化研究與教學(xué)的對(duì)接有利于培養(yǎng)學(xué)生對(duì)科研的興趣，使他們更為直觀地了解和接受科研的方法。今天的學(xué)生即是未來(lái)的文化繼承者和傳播者，地域文學(xué)和文化教育以教師科研的現(xiàn)身說(shuō)法介紹運(yùn)用中西方各種理論的、實(shí)證的、審美的方法，努力培養(yǎng)學(xué)生的人文素質(zhì)和對(duì)文學(xué)和文化學(xué)習(xí)、研究的興趣，培養(yǎng)學(xué)生思考問(wèn)題、解決問(wèn)題和創(chuàng)新創(chuàng)造的素質(zhì)能力。

1．2．3 CLEIA和ELISA方法 CLEIA法檢測(cè)步驟詳見(jiàn)文獻(xiàn)［12］，ELISA法檢測(cè)步驟詳見(jiàn)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CLEIA和ELISA檢測(cè)方法的批內(nèi)、批間精密度

在一次測(cè)定中，取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度下均進(jìn)行5次重復(fù)測(cè)定，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)(RSD);分別以5個(gè)批次測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算批間RSD。從表1、表2可見(jiàn):用CLEIA法檢測(cè)CAP的批內(nèi)、批間 RSD分別為5．5% ～11．3%和12．3% ～20．9%，用 ELISA法檢測(cè) CAP的批內(nèi)、批間 RSD 分別為 1．6% ～5．9%和 8．9% ～13．4%;用CLEIA法檢測(cè)AOZ的批內(nèi)、批間RSD分別為6．6% ～11．1%和15．6% ～18．3%，用 ELISA 法檢測(cè)AOZ的批內(nèi)、批間RSD分別為4．9% ～6．3%和14．2% ～15．0%。雖然用 CLEIA法檢測(cè)的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均高于ELISA法，但仍符合《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑 (盒)備案參考評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)》(農(nóng)醫(yī)發(fā)［2005］17號(hào)文件)的規(guī)定。該標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定:每批平行樣之間的變異系數(shù) (批內(nèi)變異系數(shù))不得大于25%，對(duì)于禁用藥物不得大于30%，而樣品之間的變異系數(shù)值 (批間變異系數(shù))不得大于30%，對(duì)于禁用藥物不得大于40%。

2.2 CLEIA和ELISA檢測(cè)方法的添加回收率

將不同濃度的AOZ、CAP添加到空白仿刺參勻漿組織中，每個(gè)濃度下進(jìn)行5次重復(fù)測(cè)定，分別測(cè)定兩種方法的添加回收率。從表3可見(jiàn):用CLEIA法檢測(cè) AOZ、CAP的回收率分別為90．7% ～ 111．9% 和 83．7% ～ 115．8%;用 ELISA法檢測(cè) AOZ、CAP的回收率分別為 84．4% ～106．7%和85．3% ～111．3%，兩種方法的回收效果相當(dāng)。

表1 CLEIA法檢測(cè)CAP和AOZ的批內(nèi)和批間精密度 (n=5)Tab.1 Intra－ and inter－assay precisions of CAP detection by chemiluminescence immunoassay(n=5)

表2 ELISA法檢測(cè)CAP和AOZ的批內(nèi)和批間精密度 (n=5)Tab.2 Intra－ and inter－assay precisions of AOZ detection by enzyme－linked immunosorbent assay(n=5)

表3 CLEIA和ELISA法檢測(cè)AOZ和CAP的添加回收率Tab.3 Added recovery of CAP and AOZ detection by CLEIA and ELISA methods μg/kg

2.3 CLEIA和ELISA檢測(cè)方法的相關(guān)性分析

對(duì)兩種分析方法的添加回收率測(cè)定結(jié)果進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析 (圖1)，結(jié)果表明，測(cè)定AOZ的回歸方程為

y=0．05356+0．90324x(r2=0．9899)，

測(cè)定CAP的回歸方程為

y=0．03698+1．03212x(r2=0．9636)。

說(shuō)明CLEIA與ELISA兩種方法具有很好的相關(guān)性，可以準(zhǔn)確篩選樣品組織中AOZ和CAP殘留。

圖1 CLEIA和ELISA法測(cè)定AOZ和CAP的相關(guān)性曲線(xiàn)Fig.1 Correlation comparison of AOZ and CAP detection by CLEIA and ELISA methods

2.4 用CLEIA法檢測(cè)水產(chǎn)品中CAP和AOZ的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢出限

測(cè)定20份空白仿刺參樣品中CAP和AOZ的含量，計(jì)算出每種樣品中CAP和AOZ的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，最低檢出限等于空白樣品檢測(cè)平均值加上3倍空白樣品檢測(cè)值的標(biāo)準(zhǔn)差。如圖2所示，用CLEIA法檢測(cè)水產(chǎn)品中AOZ和CAP，其線(xiàn)性方程分別為y=18747-7317x和 y=15102-1865x，其線(xiàn)性范圍分別為 0．01 ～ 2．56、0．025 ～6．400 μg/kg，檢出限分別為 0．01、0．016 μg/kg。用 ELISA法檢測(cè)水產(chǎn)品中AOZ和CAP，檢出限分別為0．10、0．05 μg/kg，線(xiàn)性范圍分別為 0．10 ～1．62、0．05 ～4．05 μg/kg。

圖2 CLEIA法檢測(cè)AOZ和CAP的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 Standard curves of CLEIA method for determination of AOZ and CAP

2.5 用CLEIA法檢測(cè)5種水產(chǎn)品中CAP和AOZ的殘留量

用CLEIA法檢測(cè)5種水產(chǎn)品中CAP、AOZ的殘留情況如表4所示。其中，仿刺參和海膽中未檢測(cè)出CAP殘留，而菲律賓蛤仔、魁蚶、蝦夷扇貝3種貝類(lèi)中都不同程度地檢測(cè)出CAP殘留。5種水產(chǎn)品食用組織中幾乎沒(méi)有AOZ的存在。

3 討論

本研究中通過(guò)對(duì)兩種藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，用CLEIA法檢測(cè)的線(xiàn)性范圍和檢出限均優(yōu)于ELISA法。馬玲等［13］建立了一步式檢測(cè)CAP殘留的CLEIA法，最低檢出限為0．01 μg/L;姚焱等［14］建立了檢測(cè)豬肉中CAP含量的CLEIA法，檢出限為0．018 ng/mL，而使用ELISA法的檢出限為0．177 ng/mL。本研究中，用CLEIA法檢測(cè)CAP的檢出限為0．016 μg/kg，這與以上研究結(jié)果基本一致。沈美芳等［15］運(yùn)用ELISA法檢測(cè)水產(chǎn)品中AOZ代謝物，最低檢出限為0．3 μg/kg，而本研究中，用CLEIA法檢測(cè)水產(chǎn)品中AOZ的檢出限為0．01μg/kg，明顯優(yōu)于ELISA法。

表4 用CLEIA法檢測(cè)出的水產(chǎn)品中CAP和AOZ的殘留量Tab.4 The residue levels of AOZ and CAP in fish and fishery products by CLEIA μg/kg

通過(guò)比較批內(nèi)和批間變異系數(shù)可知，CLEIA法檢測(cè)兩種藥物的變異系數(shù)相對(duì)于ELISA法均偏高，這可能是由于發(fā)光液性能不夠穩(wěn)定所致，因此，需要進(jìn)一步篩選優(yōu)化發(fā)光系統(tǒng)。另外，本研究中所用發(fā)光液不含發(fā)光增敏物質(zhì)，如果能在更優(yōu)化的發(fā)光系統(tǒng)中添加發(fā)光增敏物質(zhì)，可得到更高的檢測(cè)靈敏度。此外，在免疫試驗(yàn)操作中，也應(yīng)避免環(huán)境和人為操作的影響，盡量縮短前后孔的加樣時(shí)間，避免漂移現(xiàn)象的產(chǎn)生，減少前后孔免疫反應(yīng)的差異。雖然CLEIA法檢出的變異系數(shù)較大，但其具有前處理簡(jiǎn)單、高通量、檢出靈敏度高、線(xiàn)性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，使其在樣品初篩檢測(cè)技術(shù)中具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)［16］。

目前，對(duì)于禁用藥物CAP和硝基呋喃類(lèi)代謝物，歐盟在水產(chǎn)品中制定的最低執(zhí)法限量 (Minimum required performance limit，MRPL)分別為0．3、1．0 μg/kg，中國(guó)規(guī)定為不得檢出，但中國(guó)檢測(cè)分析的靈敏度和檢測(cè)方法與歐盟存在一定的差距，水產(chǎn)品質(zhì)量不符合歐盟的要求，出口水產(chǎn)品屢遭受阻，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。中國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定:用ELISA法檢測(cè)動(dòng)物源性 CAP的檢出限為 0．05 μg/kg，定量限為 0．25 μg/kg［17］，高效液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源食品中AOZ的檢出限為0．25 μg/kg，定量限為 0．5 μg/kg［18］。本研究中，3種貝類(lèi)中CAP被不同程度地檢出，但由于CLEIA法屬于快速檢測(cè)初篩法，其檢出結(jié)果是否低于歐盟最低執(zhí)法限量，需要用GC-MS、LC-MS等方法確證。本研究結(jié)果顯示，個(gè)別地區(qū)可能還存在違規(guī)使用CAP的現(xiàn)象，需要相關(guān)部門(mén)加以監(jiān)督;而5種水產(chǎn)品食用組織中幾乎沒(méi)有AOZ代謝物的存在，符合歐盟及中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

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