蒙小云 ，鄭 華 *，李 勇，夏代剛 ，竇紅偉 ，石 偉 ，田家寧

（1. 深圳市農(nóng)牧實(shí)業(yè)有限公司，深圳 518023；2. 深圳華大方舟生物技術(shù)有限公司，深圳 518083）

本研究旨在優(yōu)化克隆豬胚胎移植技術(shù)，力求降低操作成本、提高效率和簡(jiǎn)化操作，推進(jìn)克隆豬試驗(yàn)向產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用邁進(jìn)。豬的克隆相對(duì)于牛羊等家畜難度大，直到2000年才獲得世界首例體細(xì)胞克隆豬。國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展了不少克隆豬試驗(yàn)，豬的克隆效率基本維持在1%～2%。胚胎移植成功率是影響克隆豬效率的主要因素。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中所需材料包括：斷奶發(fā)情母豬、培育好的克隆胚胎數(shù)枚、無(wú)菌操作實(shí)驗(yàn)室、手術(shù)臺(tái)、手術(shù)麻醉系統(tǒng)一套、手術(shù)刀、縫合針線等。要求試驗(yàn)?zāi)肛i單獨(dú)飼養(yǎng)，術(shù)前清潔并徹底消毒；移植的胚胎要求發(fā)育良好，嚴(yán)格按照恒溫38.5 ℃保存；手術(shù)前對(duì)手術(shù)室進(jìn)行24 h紫外線照射處理；對(duì)手術(shù)人員手術(shù)前做好消毒凈化工作；手術(shù)所用的刀具、耗材做好消毒滅菌工作。確保胚胎移植過(guò)程處于無(wú)菌操作。

1.2 胚胎的建系及選擇

1.2.1 供體的選擇

在試驗(yàn)開(kāi)始前，根據(jù)公司種豬群育種數(shù)據(jù)，選擇遺傳指數(shù)高的，生產(chǎn)性能好的公豬作為此次試驗(yàn)的供體。

1.2.2 體細(xì)胞采樣

保定好供體，采樣人員對(duì)供體耳緣周邊進(jìn)行消毒清理，剃掉皮膚上層的絨毛，用采樣器剪取0.5 cm×0.5 cm的耳肉，裝入樣品管，放入專(zhuān)用冷凍箱保存。

1.2.3 胚胎建系

將采好的樣品送至深圳華大方舟生物技術(shù)有限公司進(jìn)行胚胎建系。

1.2.4 胚胎選擇

建好胚胎系之后，胚胎挑選原則是盡量選取形態(tài)良好、擴(kuò)張充分、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)明顯的囊胚。

1.3 胚胎受體的選擇

胚胎受體的選擇主要關(guān)注以下幾方面：分娩過(guò)程長(zhǎng)短正常、異常仔豬少、產(chǎn)后恢復(fù)快、未有子宮炎癥狀及奶水好的母豬，同時(shí)選擇斷奶發(fā)情要在7 d以內(nèi)的母豬，而且發(fā)情癥狀要很明顯。

1.4 移植時(shí)間

1.4.1 受體斷奶時(shí)間

在確定了手術(shù)移植時(shí)間后，反推母豬斷奶時(shí)間，即手術(shù)時(shí)間反推5 d為發(fā)情日期，發(fā)情日期反推6 d為斷奶日期。

1.4.2 移植胚胎發(fā)育日齡

經(jīng)過(guò)手工克隆出來(lái)的，發(fā)育6 d的胚胎。

1.5 手術(shù)前的準(zhǔn)備工作

1.5.1 移植胚胎的準(zhǔn)備

用專(zhuān)門(mén)的揀胚器對(duì)擬移植的胚胎進(jìn)行分揀并裝入麥管，每頭受體母豬準(zhǔn)備2個(gè)麥管，每個(gè)麥管大約裝入30枚胚胎。將裝好胚胎的麥管放入恒溫的運(yùn)輸箱。

1.5.2 受體母豬

對(duì)斷奶母豬進(jìn)行斷奶后優(yōu)飼，確保受體母豬發(fā)情良好，發(fā)情后對(duì)受體母豬實(shí)行單欄飼養(yǎng)，術(shù)前做好清洗及消毒工作，手術(shù)前12 h禁食。

1.5.3 手術(shù)儀器準(zhǔn)備和檢查

準(zhǔn)備手術(shù)器械，紗布鍋，手術(shù)服，外科手術(shù)手套、口罩、縫線、洞巾、磺胺、生理鹽水、碘酊、酒精、酒精棉。對(duì)所有進(jìn)入手術(shù)室的器材都要進(jìn)行滅菌處理。首先確定手術(shù)需要幾套滅菌器材，滅菌前用洗潔精清洗器材，然后通過(guò)高壓蒸汽鍋進(jìn)行高壓高溫滅菌；高壓蒸汽鍋在103.4 kPa蒸汽壓下，溫度達(dá)到121.3 ℃，維持15～20 min，即可達(dá)到滅菌的效果；已滅菌的物品做好標(biāo)記，與未滅菌的物品分開(kāi)保存，以免弄錯(cuò)。

1.6 克隆豬胚胎的移植手術(shù)

1.6.1 先期麻醉及固定

肌注受體母豬8～10 mL阿托品，抗痙攣，15 min后靜脈注射舒泰50，體重小于等于150 kg使用2～2.2 mL，大于150 kg使用2.2～2.8 mL。然后將受體母豬固定到手術(shù)架上；在手術(shù)過(guò)程中為了維持麻醉狀態(tài)，我們使用動(dòng)物麻醉機(jī)來(lái)達(dá)到這個(gè)效果。動(dòng)物麻醉機(jī)的原理是結(jié)合氧氣和笑氣的混合氣體以及揮發(fā)性異氟烷來(lái)維持麻醉作用。通過(guò)這種辦法使受體母豬在整個(gè)手術(shù)過(guò)程中處于麻醉狀態(tài)，方便了手術(shù)操作。

1.6.2 開(kāi)腹手術(shù)

步驟1：鋪開(kāi)洞巾，用4個(gè)持巾鉗固定于皮膚表面，避免夾到乳頭，影響后期泌乳。

步驟2:在倒數(shù)第2、 3個(gè)乳頭之間，用手術(shù)刀切開(kāi)皮膚及皮下結(jié)締組織，準(zhǔn)備止血紗布和止血鉗用以較小血管止血，提前準(zhǔn)備非吸收性外科縫線，時(shí)刻準(zhǔn)備對(duì)較大出血血管進(jìn)行結(jié)扎。

步驟3：用止血鉗或手術(shù)刀沿腹白線進(jìn)行分離脂肪層。

步驟4：分離脂肪層直至腹膜，切開(kāi)腹膜。

步驟5：紗布攤開(kāi)，上面噴灑一定量的生理鹽水，防止子宮脫水。

步驟6：從腹腔引出子宮，檢查卵巢的排卵情況，遇到排卵時(shí)間過(guò)早或過(guò)晚或子宮粘連嚴(yán)重的情況時(shí)，需放棄移植，更換受體。

步驟7：找到宮管結(jié)合處，用滅菌鈍性針頭扎一個(gè)小孔，整個(gè)過(guò)程要適時(shí)向子宮噴灑生理鹽水，保持子宮濕潤(rùn)，不致脫水。

步驟8：用移植導(dǎo)管將胚胎緩慢輸入子宮角，然后用手指或止血鉗夾持小孔一段時(shí)間，防止出血。

步驟9：另一側(cè)子宮同上進(jìn)行。

1.6.3 縫合

胚胎注射完畢后，需要對(duì)受體母豬進(jìn)行術(shù)部縫合，具體步驟如下：

步驟1：止血紗布清除手術(shù)部位的血漬，將子宮還原入體內(nèi)，在腹腔內(nèi)加少量的生理鹽水清洗腹腔，在腹腔內(nèi)灌入右旋糖酐50 mL和2:160萬(wàn)單位青霉素。

步驟2：采用連續(xù)縫合法用吸收性外科縫線對(duì)腹膜進(jìn)行縫合，縫合時(shí)，針間距不宜過(guò)大，過(guò)大會(huì)導(dǎo)致腸管露出腹腔發(fā)生疝氣，以小于1 cm為宜。

步驟3：同樣方法對(duì)肌肉層和脂肪層進(jìn)行縫合，撒磺胺，進(jìn)行消炎。

步驟4：用非吸收性縫線縫合皮膚層，采用結(jié)節(jié)性縫合。

步驟5：縫合完畢，用手術(shù)鑷將縫合部位皮膚外翻，便于愈合，手術(shù)鑷夾碘酊消毒手術(shù)部位。

步驟6：關(guān)掉麻醉罐，為保證麻醉動(dòng)物安全，可繼續(xù)通氧氣，輔助呼吸一段時(shí)間。

1.7 術(shù)后管理及觀察

待受體母豬完全清醒后，單獨(dú)飼養(yǎng)管理，視傷口愈合情況決定是否需要相應(yīng)治療。如恢復(fù)良好，按照配種后1個(gè)月母豬標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)管理，在28 d時(shí)通過(guò)B超進(jìn)行查孕，確定受體是否懷孕。

2 結(jié)果與分析

2012年10月-12月，我們用手術(shù)法共開(kāi)展16頭母豬的克隆豬胚胎移植試驗(yàn)（表1）。結(jié)果14頭手術(shù)法移植的母豬全部陸續(xù)返情，移植分娩率僅為12.5%（2/16），一窩產(chǎn)了3頭木乃伊，另一窩產(chǎn)了3頭活仔和1頭木乃伊，移植效果不理想。

2013年6月，我們根據(jù)手術(shù)法改進(jìn)方案開(kāi)展了8頭母豬的克隆豬胚胎移植試驗(yàn)，此輪受體代孕母豬全部選用了長(zhǎng)白經(jīng)產(chǎn)母豬，8頭豬分娩了4窩，其余4頭母豬返情。本輪手術(shù)法移植分娩率為50%（4/8），共分娩26頭活仔和4頭死胎，窩均分娩6.5頭活仔和1頭死胎，移植效果比較理想。

2013年6月根據(jù)改進(jìn)方案手術(shù)移植的母豬有4頭過(guò)了一個(gè)情期沒(méi)有返情，而且用超聲波檢測(cè)已經(jīng)懷孕，堅(jiān)定了我們對(duì)試驗(yàn)成功的信心。于是，8月8日和8月18日我們又手術(shù)法移植了2頭母豬，結(jié)果分別于11月24日和12月5日分娩，分別分娩8頭和4頭活仔，分娩率達(dá)到了100%(2/2)，窩均分娩6頭活仔。

綜合2013年6—8月的手術(shù)法胚胎移植結(jié)果，10頭受體母豬合計(jì)分娩率達(dá)到60%（6/12），窩均分娩活仔6.33頭（38/6）。

3 討論

影響豬克隆試驗(yàn)成敗的因素很多，吳蓉花等綜述了提高豬胚胎發(fā)育能力和克隆效率的研究進(jìn)展。本試驗(yàn)通過(guò)不斷摸索和總結(jié)，優(yōu)化了胚胎移植操作，逐步提高了胚胎移植成功率。主要的優(yōu)化措施包括：

表1 第1批手術(shù)法克隆豬胚胎移植試驗(yàn)結(jié)果

表2 改良后手術(shù)法克隆豬胚胎移植試驗(yàn)結(jié)果

2.1 胚胎建系的優(yōu)化

供體采樣時(shí)，樣本是否被污染，以及供體本身的年齡、健康狀況等因素對(duì)胚胎的建系和發(fā)育都有一定的影響，考慮到以上因素，在后面的供體采樣時(shí)我們分別嘗試了皮下脂肪采樣以及胎豬采樣，從建系的情況來(lái)看，明顯的優(yōu)于耳緣采樣。

根據(jù)之前采樣及移植情況來(lái)看，供體體細(xì)胞采樣受供體本身發(fā)育情況、體細(xì)胞分化及甲基化影響、樣本保存運(yùn)輸情況等因素影響較大，結(jié)合這些情況我們通過(guò)采取30 d懷孕母豬的胚胎，作為體細(xì)胞提取樣本，能大大的優(yōu)化胚胎的建系成功率。

2.2 受體選擇的優(yōu)化

對(duì)有子宮炎癥，有子宮粘連、水腫、發(fā)育不理想等的受體母豬應(yīng)放棄移植。由于我場(chǎng)兼顧生產(chǎn)，在選擇受體母豬時(shí)沒(méi)有太過(guò)嚴(yán)格地篩選，實(shí)驗(yàn)個(gè)體水平參差不齊，這是導(dǎo)致第1批移植試驗(yàn)成功率低的主要原因。從第2批胚胎移植開(kāi)始，在選擇受體時(shí)，盡量選擇年齡適中、生命力旺盛、分娩時(shí)無(wú)異常產(chǎn)仔、子宮產(chǎn)后恢復(fù)良好、產(chǎn)房無(wú)發(fā)病情況、哺乳性能良好、斷奶發(fā)情時(shí)間準(zhǔn)確、發(fā)情特征明顯的母豬。

2.3 手術(shù)操作的標(biāo)準(zhǔn)化

手術(shù)法開(kāi)展胚胎移植，任何細(xì)微的不當(dāng)操作都足以導(dǎo)致胚胎無(wú)法著床和死亡。本試驗(yàn)通過(guò)摸索總結(jié)出了一套手術(shù)法克隆豬胚胎移植操作標(biāo)準(zhǔn)，雖然目前僅僅是企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，相信通過(guò)不斷修訂和完善，可逐步上升成行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 術(shù)后管理的優(yōu)化

手術(shù)后，胚胎進(jìn)入受體子宮內(nèi)，能否著床及發(fā)育，這與受體子宮的內(nèi)部環(huán)境、激素分泌、營(yíng)養(yǎng)狀況以及疾病的影響是分不開(kāi)的。術(shù)后對(duì)受體母豬的飼養(yǎng)管理應(yīng)細(xì)致，注意觀察受體母豬手術(shù)恢復(fù)情況，有無(wú)被感染，是否需治療，母豬飼喂料量應(yīng)根據(jù)母豬體況適當(dāng)調(diào)整。細(xì)致的管理是保障克隆胚胎在子宮內(nèi)著床及發(fā)育的關(guān)鍵因素。