江春春 ，張任娜 ，賈亞偉 ，韓少鵬 ，王苗苗 ，朱建國(guó) *

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；2.圣克魯斯生物技術(shù)(上海）有限公司；3.江蘇天兆實(shí)業(yè)有限公司，江蘇 灌南 223500)

豬瘟又稱古典豬瘟(CSF)，是由黃病毒科、瘟病毒屬的豬瘟病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，而豬是該病毒的唯一自然宿主［1］，由于造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，世界各國(guó)特別是養(yǎng)豬大國(guó)極為重視，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列入必須上報(bào)的傳染病之一。

近年來(lái)，許多養(yǎng)豬場(chǎng)反映豬瘟免疫狀況不理想。決定免疫成敗的原因是多方面的，而免疫程序是其中最重要的因素之一［2］。尤其是對(duì)于早期階段的仔豬，母源抗體水平是制定免疫程序首要的考慮因素［3］。就國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬場(chǎng)來(lái)講，豬瘟首免時(shí)間參差不齊，早晚不一。造成這種局面的原因主要是對(duì)于母源抗體消長(zhǎng)時(shí)間認(rèn)識(shí)不一致。鑒于此，我們用ELISA方法對(duì)某集約化豬場(chǎng)不同免疫階段的仔豬豬瘟抗體進(jìn)行了檢測(cè)分析，之后同樣檢測(cè)分析了首免后及二免后的仔豬的豬瘟病毒抗體水平與免疫力狀況，旨在為不同規(guī)模豬場(chǎng)制定科學(xué)、有效的豬瘟免疫程序提供借鑒。

1 材料

1.1 血清樣本

某集約化豬場(chǎng)送檢的一免前（4周齡），以及調(diào)整免疫程序一免后（6周齡）和二免后（10周齡）的仔豬血清。

1.2 檢測(cè)試劑盒

IDEXX 豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于上海賽嘉生物科技有限公司。

2 檢測(cè)方法及內(nèi)容

2.1 豬瘟病毒抗體的檢測(cè)方法及步驟

采用ELISA方法，用IDEXX豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒，按照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，結(jié)果判定：若被檢樣本的阻斷率≥40%，該樣本就可以被判為陽(yáng)性；若被檢樣本的阻斷率≤30%，該樣本就可以被判為陰性。

1）在使用時(shí)，所有的試劑盒組分都必須恢復(fù)到室溫18～25 ℃。使用前應(yīng)將各組分放置于室溫條件下至少1 h。

2）分別將50μL 樣品稀釋液加入每個(gè)檢測(cè)孔和對(duì)照孔中。

3）分別將50μL的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照加入相應(yīng)的對(duì)照孔中，注意不同對(duì)照的吸頭要更換，以防污染。

4）分別將50μL的被檢樣品加入剩下的檢測(cè)孔中，注意不同檢樣的吸頭要分開(kāi)，以防污染。

5）輕彈微量反應(yīng)板或用振蕩器振蕩，將反應(yīng)板中的溶液混勻。

6）將微量反應(yīng)板用封條封閉或于恒溫濕箱中（18～25 ℃）孵育2 h，也可以將微量反應(yīng)板用封條封閉或于恒溫濕箱中孵育過(guò)夜。

7）吸出反應(yīng)孔中的液體，并用稀釋好的洗滌液洗滌3 次，注意每次洗滌時(shí)都要將洗滌液加滿反應(yīng)孔，棄去反應(yīng)孔中的洗滌液并拍干反應(yīng)板。也可以用洗板機(jī)洗滌3 次，每個(gè)反應(yīng)孔應(yīng)加300μL左右的洗滌液。注意洗板時(shí)要小心，以免樣本之間的交叉污染。

8）分別將100μL辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)的抗豬瘟病毒的酶標(biāo)抗體（即取即用）加入反應(yīng)孔中，用封條封閉反應(yīng)板并于室溫下或恒溫濕箱中孵育30 min。

9）重復(fù)步驟7。

10）每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μL的底物溶液，并于避光、室溫條件下放置10 min。加完第1孔后即可計(jì)時(shí)。

11)在反應(yīng)孔中加入100μL的終止液終止反應(yīng)。注意要按加酶標(biāo)二抗的順序加終止液。

12)在450 nm 處測(cè)定樣本以及對(duì)照的吸光度值，也可用雙波長(zhǎng)（450 nm 和650 nm）測(cè)定樣本以及對(duì)照的吸光度值，空氣調(diào)零。

13)計(jì)算樣本和對(duì)照的平均吸光度值。

表 1 4周齡(一免前)仔豬豬瘟抗體(母源)水平檢測(cè)結(jié)果

表 2 一免后（6周齡）和二免后（10周齡）仔豬豬瘟抗體水平檢測(cè)結(jié)果

表3 對(duì)4周齡(一免前)仔豬豬瘟抗原水平檢測(cè)

表4 對(duì)豬瘟一免和二免后仔豬的豬瘟抗原水平檢測(cè)

2.2 檢測(cè)內(nèi)容

1)對(duì)4周齡(一免前)仔豬豬瘟抗體(母源)水平檢測(cè)。

2)對(duì)豬瘟一免和二免后仔豬豬瘟抗體水平檢測(cè)。

3）調(diào)整免疫程序（豬瘟首免由6周齡提前至4周齡）后豬瘟一免和二免后仔豬豬瘟抗體水平檢測(cè)。

3 結(jié)果分析

3.1 4周齡(一免前)仔豬豬瘟抗體(母源)水平檢測(cè)

由表1看出，4周齡（首免前）仔豬豬瘟（母源）抗體水平偏低，平均為38.75%。

3.2 調(diào)整免疫程序后仔豬豬瘟抗體水平檢測(cè)

由表2 可看出，豬瘟首免由6周齡提前至4周齡后，其一免和二免的仔豬豬瘟抗體水平有明顯的提高，平均值分別為55.3%和62.65%。

3.3 仔豬豬瘟抗原水平檢測(cè)

1）由表3 可看出，對(duì)4周齡(一免前)的仔豬進(jìn)行豬瘟抗原水平檢測(cè)，有2個(gè)批次出現(xiàn)了豬瘟抗原陽(yáng)性（2014年2月的13.33%和2014年3月的3%），而2013年12月出現(xiàn)了數(shù)量較多的可疑樣品（7/30）。

2）由表4看出，調(diào)整免疫程序后對(duì)豬瘟一免和二免后仔豬的豬瘟抗原水平檢測(cè)結(jié)果全部為陰性。

4 討論

豬瘟母源抗體是指仔豬通過(guò)攝入分娩母豬初乳而獲得的具有對(duì)豬瘟先天性保護(hù)的特異性免疫球蛋白。隨著仔豬日齡的增長(zhǎng)，母源抗體滴度緩慢下降，同時(shí)對(duì)豬瘟的先天性保護(hù)也隨之降低[4]。而母源抗體持續(xù)時(shí)間和滴度直接決定了豬瘟首免時(shí)間，首次免疫過(guò)早，疫苗會(huì)被血清中尚處在較高水平的母源抗體抵消，難以發(fā)揮免疫作用，而首免過(guò)晚，無(wú)疑會(huì)使仔豬免疫出現(xiàn)低谷期甚至空檔期，處在感染野毒的高風(fēng)險(xiǎn)期。

通過(guò)對(duì)集約化養(yǎng)豬場(chǎng)4周齡（首免前）仔豬豬瘟病毒抗體水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（表1），4周齡（首免前）仔豬豬瘟（母源）抗體水平偏低，平均為38.75%，這意味著此時(shí)仔豬群母源抗體對(duì)仔豬的保護(hù)力比較弱，如果不及時(shí)進(jìn)行免疫，往往很容易發(fā)生豬瘟病毒的早期感染。在對(duì)4周齡仔豬血清進(jìn)行豬瘟抗體檢測(cè)的同時(shí)也檢測(cè)了豬瘟抗原（表3），結(jié)果是有2個(gè)批次出現(xiàn)了豬瘟抗原陽(yáng)性（2014年2月的13.33%和2014年3月的3%），而2013年12月出現(xiàn)了數(shù)量較多的可疑樣品（7/30），而調(diào)整免疫程序后對(duì)豬瘟一免和二免后仔豬豬瘟抗原水平檢測(cè)結(jié)果全部為陰性（表4）。這從一定程度上也說(shuō)明此時(shí)仔豬群容易感染豬瘟野毒。鑒于此，該場(chǎng)及時(shí)調(diào)整免疫程序，將豬瘟首免由6周齡提前至4周齡，分別對(duì)豬瘟一免后（6周齡）和二免后（10周齡）的仔豬進(jìn)行豬瘟病毒抗體檢測(cè)，其一免和二免的仔豬豬瘟抗體水平有明顯的提高，平均值分別為55.3%和62.65%。這意味著將首免提至4周齡后，6周齡的抗體水平肯定比調(diào)整前提高了；也說(shuō)明該場(chǎng)調(diào)整豬瘟免疫程序，將首免時(shí)間由6周齡提前至4周齡對(duì)于改善仔豬豬瘟免疫狀況有一定作用。

養(yǎng)豬業(yè)一直是我國(guó)畜牧業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，是農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的重要組成部分。但大多數(shù)養(yǎng)殖戶還缺乏根據(jù)豬場(chǎng)定期的抗體水平監(jiān)測(cè)結(jié)果確定科學(xué)免疫程序的意識(shí)，主要依靠自身經(jīng)驗(yàn)，或照搬他人程序，免疫程序混亂(如增加免疫密度、劑量、盲目超前免疫等)，致使豬瘟仍沒(méi)有得到有效控制。豬瘟的免疫程序有多種，最合理的免疫程序應(yīng)是每個(gè)豬場(chǎng)要根據(jù)自己豬場(chǎng)的實(shí)際情況(主要是豬瘟抗體水平變化規(guī)律)，并根據(jù)血清抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果及時(shí)調(diào)整制定符合本場(chǎng)實(shí)際的免疫程序。

[1］ 王火平．仔豬豬瘟超前免疫的研究[J].福建畜牧獸醫(yī)，2005，27(4): 8-9.

[2] 苗得園．Herdchek豬瘟抗體ELISA試劑盒在豬瘟控制中的應(yīng)用[J]．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2006，42(11)：50-51．

[3] KLnig M，Leng sfeld T，Pau iy T，et a1．Classical swine fever virus：mdependent induction of protective immunity by two structural glycoproteins[J]．J Virol，1995，69(10)：6479-6486．

[4] Terpstra C．The immunity against challenge with swine fever virus of piglets from sows vaccinated with C-strajnvaccine[J]． Tijdschrift Voor Diergeneeskunde(Amsterdam),1977,102:1293-1298.