甘凝嵐，顏春榮，徐春祥

（江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，江蘇 南京 210007）

甲醛具有強烈的刺激性氣味，對人體具有較高的毒性，長期接觸對神經(jīng)系統(tǒng)、肺、肝臟均有損害[1]。世界衛(wèi)生組織將甲醛確定為致癌、致畸物質(zhì)和公認的變態(tài)反應(yīng)源[2]，我國食品添加劑使用衛(wèi)生標準中規(guī)定嚴禁將甲醛及其化合物用作食品添加劑[3-4]。近來不斷有鴨血中發(fā)現(xiàn)甲醛的報道，在鴨血中加入甲醛，可使鴨血長時間保鮮，不易腐爛，與此同時，還可以促進蛋白質(zhì)的凝固，提高鴨血韌度，起到增加口感的作用[5]。但甲醛極易殘留在鴨血中大量小孔上，消費者在食用時并無法有效清洗鴨血中的殘留甲醛，這必將對消費者造成極大的傷害。若殘留物中超過10 mL的甲醛被人食用，則將直接威脅到生命安全。因此，為保障消費者食品安全，有必要針對鴨血中甲醛含量研究出快速、準確的高效液相色譜檢測方法。

目前，常用的甲醛檢測方法主要有分光光度法[6]、氣相色譜法[7]、高效液相色譜法[8-11]、示波極譜法[12]、流動注射化學發(fā)光法等[13]。分光光度法由于前處理采用蒸餾法[14-17]，操作不易控制，回收率較低；示波極譜法多用于公共場所空氣中的甲醛的測定；流動注射化學發(fā)光法多用于密胺餐具浸泡液中甲醛的測定。與之相比，色譜法[18-21]多用于食品中甲醛的測定，具備準確度高、抗干擾能力強等特點[22]，能夠更好地對樣品中目標物進行準確地定性、定量。目前在已有文獻中，高效液相色譜法測定甲醛的前處理方法較為復(fù)雜，例如需要提取后再衍生化、需要精確調(diào)節(jié)衍生液pH值、衍生化時間過長等，本實驗通過對提取條件和衍生條件等進行方法學研究，建立了適合用于鴨血中甲醛測定的高效液相色譜方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用水為煮沸10 min后冷卻的超純；所用器皿用水洗凈后再于100 ℃烘箱內(nèi)烘1～2 h。

甲醛標準溶液 國家標準物質(zhì)中心；乙腈（色譜純）、乙酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；2,4-二硝基苯肼（純度≥99%） 上海試劑總廠第三分廠。

1.2 儀器與設(shè)備

2695型高效液相色譜儀（配有紫外檢測器和Epower色譜工作站） 美國Waters公司；SB-520DT型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技有限公司；Avanti J-E型離心機 美國貝特曼庫爾特公司；XS-205DU型電子天平瑞士梅特勒-托利多公司；XW-80A漩渦混合器 上海青浦滬西儀器廠；DK-98-Ⅱ電爐 天津市泰斯特儀器有限公司；HH-2恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；IKA T18型勻漿機 廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters SunFireC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（65∶35，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：365 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.2 樣品處理

1.3.2.1 溶液配制

2,4-二硝基苯肼乙腈溶液：稱取300 mg 2,4-二硝基苯肼用乙腈定容至500 mL，配制成0.6 g/L 2,4-二硝基苯肼乙腈溶液；衍生液：將配制好的2,4-二硝基苯肼腈溶液與超純水按體積比1∶1混合均勻；緩沖溶液：稱取2.64 g乙酸鈉，以水溶解，加入1.0 mL冰乙酸，用水定容至500 mL。

1.3.2.2 樣品提取

準確稱取用勻漿機粉碎后的試樣1 g（精確至0.01 g），于50 mL具塞離心管中，準確加入20 mL衍生液，渦旋混合均勻，40 ℃超聲40 min后取出后冷卻至室溫。

1.3.2.3 樣品凈化

將提取液以8 000 r/min離心3 min，取適量上清液過0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液供液相色譜測定。

1.3.3 標準曲線溶液的配制

分別吸取不同體積甲醛標準液，按1.3.2節(jié)所述衍生后，制成質(zhì)量濃度為0.4、1、2、3、4、5、6 μg/mL標準曲線溶液，進行高效液相色譜紫外檢測，根據(jù)樣品的保留時間定性，以峰面積為縱坐標，以甲醛質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生液的選擇

2,4-二硝基苯肼是甲醛色譜分析中常用的衍生化試劑，易溶于有機酸、甲醇和乙腈，微溶于水。為了增加其溶解性一般采用稀鹽酸作為介質(zhì)。但甲醛與2,4-二硝基苯肼在弱酸性緩沖溶液中反應(yīng)結(jié)果極不穩(wěn)定，影響衍生化效率。本實驗用乙腈配制2,4-二硝基苯肼，使衍生試劑有足夠溶解性，保證衍生化效率。

實驗比較了2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-水（1∶1，V/V）、2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-pH 5緩沖溶液（1∶1，V/V）、2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-pH 2緩沖溶液（1∶1，V/V），分別對同一鴨血樣品的甲醛衍生液進行測定。結(jié)果見圖1。結(jié)果表明：超純水的體系中甲醛的測定值最高；pH 2體系的甲醛測定值與pH 5體系接近，因此實驗選用超純水作為衍生化提取液。

圖1 不同衍生液實驗結(jié)果Fig.1 Selection of optimal derivatization agent for formaldehyde

2.2 衍生反應(yīng)時間的選擇

實驗研究了衍生時間分別為 20、30、40、50、60 min時，同一樣品衍生液中甲醛的含量。檢測結(jié)果見圖2，結(jié)果表明，隨著時間的延長測得甲醛衍生物的峰面積逐漸增大，在40 min后趨于平緩因此，實驗選用40 min為樣品衍生反應(yīng)時間。

圖2 衍生時間對反應(yīng)的影響Fig.2 Selection of optimal derivatization time

2.3 方法驗證

2.3.1 最低檢出限和定量限

準確稱取1 g空白樣品，用20 mL衍生液提取后，以進樣量10 μL基線噪音的3 倍為最低檢出限計算，甲醛的最低檢出限約為0.2 mg/kg。以進樣量10 μL基線噪音的10 倍為最低定量限計算，甲醛的最低定量限約為0.5 mg/kg。

2.3.2 工作曲線和線性范圍

分別吸取1.3.3節(jié)配制的系列標準工作液，按1.3.1節(jié)色譜條件上機測定，以峰面積Y對甲醛質(zhì)量濃度X計算線性回歸方程。在線性范圍0.4～6.0 μg/mL，回歸方程為Y=2.80×105X－2.51×104，線性相關(guān)系數(shù)0.999 7。

2.3.3 精密度實驗

吸取標準工作液0.4、3.0 μg/mL和6.0 μg/mL，重復(fù)進樣6 次，以峰面積計算精密度，結(jié)果見表1。相對標準偏差值介于1.95%～2.38%之間，精密度良好。

表1 精密度實驗結(jié)果Table 1 Precision of the method

2.3.4 回收率

圖3 3 mg/L甲醛標準溶液(A)、鴨血樣品（B）、鴨血樣品3 mg/L甲醛加標（C）色譜圖Fig.3 Chromatograms of formaldehyde standard (3 mg/L) (A), duck blood product sample (B), spiked duck blood product sample (3 mg/L) (C)

取空白鴨血樣品9 份，按低、中、高3 個水平加標，按照1.3.2節(jié)樣品處理方法處理樣品后，按1.3.1節(jié)色譜條件上機測定，色譜圖見圖3，測得甲醛的加標回收率見表2?；厥章史秶鸀?5.1%～92.7%，相對標準偏差均小于5.0%，符合分析要求。

表2 樣品加標回收率Table 2 Recovery of formaldehyde in spiked samples

2.4 未知樣品中甲醛含量的測定

利用本方法對某市公安局提供的5 個批次的鴨血樣品進行檢測，檢測結(jié)果見表3。由檢測結(jié)果分析，未添加甲醛的血液樣品未檢出甲醛，可以排除血液甲醛本底的干擾，其余4 批次鴨血塊均為陽性。且測得甲醛含量較高，可推斷為人為添加甲醛的樣品。

表3 實際鴨血樣品中甲醛的含量（n=3）Table 3 Formaldehyde contents in real samples determined by the method (n=3)

3 結(jié) 論

本實驗建立了柱前衍生、液相色譜-紫外檢測器對鴨血進行檢測。結(jié)果表明，本方法可以基本排除鴨血制品中本底值的干擾，若檢出陽性樣品，則人為添加的可能性極大。該方法無需調(diào)節(jié)衍生液pH值且提取與衍生化同時進行，大大縮短前處理時間，具有前處理操作簡便、靈敏度高、專屬性強、精密度高等優(yōu)點，且本方法定量限達到0.5 mg/kg，可以為鴨血制品中甲醛的檢測提供較為準確、可靠地分析方法，為鴨血制品的質(zhì)量控制和安全評價提供科學依據(jù)。

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