王倩文，徐 坤，袁玉清

（青島農業(yè)大學中心實驗室，山東 青島 266109）

在啤酒的生產過程中，還原糖質量濃度的變化參數(shù)是發(fā)酵進程的重要指標[1]，同時還原糖作為一種重要的營養(yǎng)成分對評價食品營養(yǎng)價值有重要的作用[2]，因此準確快速測定其還原糖質量濃度具有重要的實際意義。傳統(tǒng)檢測食品中果糖、葡萄糖含量的方法主要有：化學滴定法[3-5]、酶比色法[6-7]、光譜法[8-10]、氣相色譜質譜法[11-14]、高效液相色譜法[15-20]等。其中化學滴定法只能測定樣品中還原糖總量而不能準確測定單種糖的含量；酶比色法只能測定專一組分且檢測結果受到酶純度、酶活性的嚴重影響；光譜法工作繁瑣、誤差較大；氣相色譜質譜法需要進行衍生化反應，操作困難、不利于快速分析；液相色譜法檢出限低、抗干擾能力差，尤其對于食品中低濃度存在的果糖、葡萄糖很難進行精確的測定，已經不能滿足現(xiàn)階段對食品檢測快速、靈敏、準確的要求。在此基礎上提出利用超高效液相色譜-四極桿質譜聯(lián)用儀測定食品中微量的果糖、葡萄糖含量。通過優(yōu)化色譜條件（色譜柱的選擇、流動相的比例和流速），實現(xiàn)果糖、葡萄糖在色譜柱中的良好分離；通過優(yōu)化質譜條件（質譜檢測模式、碎裂電壓、碰撞能量），優(yōu)化檢出的線性范圍、降低目標物的檢出限、提高檢測的重現(xiàn)性。最終結果表明該方法快速、靈敏、重現(xiàn)性好、準確度高，檢出限可達0.1×10－6甚至更低數(shù)量級，大大優(yōu)于其他各類檢測方法，實現(xiàn)了對啤酒中微量果糖和葡萄糖含量的準確測定，對開發(fā)食品樣品中微量還原糖含量的檢測方法具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果糖、葡萄糖標準品（純度≥98%） 中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純） 德國Merck公司；甲酸、乙酸銨（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1290/6460 超高效液相色譜-四極桿質譜聯(lián)用儀美國Agilent公司；Elmasonic P超聲波清洗器 德國Elma公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流動相：水（質量分數(shù)0.5%甲酸，質量分數(shù)0.2%乙酸銨）∶乙腈（10∶90，V/V）；流速：0.8 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源；負離子掃描；多反應監(jiān)測；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L/min；電噴霧壓力25 psi；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：8 L/min；毛細管電壓：3 500 V。葡萄糖、果糖各自的質譜分析參數(shù)見表1。

表1 果糖、葡萄糖的質譜分析參數(shù)Table l Mass spectral parameters for fructose and glucose

2 結果與分析

2.1 液相條件的選擇

本實驗選擇填料為新型材料亞乙基橋雜化顆粒的Waters Acquity色譜柱，該色譜柱可用于正相模式，對小分子糖類物質具有良好的保留和分離作用；并且該色譜柱耐高壓達1 500 psi，完全適用于超高壓液相色譜儀使用。

實驗選擇水和乙腈的混合液為流動相，其中水相中含有質量分數(shù)0.5%和質量分數(shù)0.2%乙酸銨。甲酸的加入是為了提高檢測物質的離子化效率，使檢出信號增強。實驗證明質量分數(shù)0.5%的甲酸既能保證流動相基質對測定結果不構成干擾，又能有效增強待測物質的檢出信號。乙酸銨的引入可以有效抑制分析物質準分子離子峰的加鈉和加鉀現(xiàn)象，增強其在質譜當中的穩(wěn)定性，提高檢測的靈敏度。

眾所周知，果糖和葡萄糖是同分異構的單糖，分子結構相似，它們的二級特征碎片也有極高的相似度。因此，用質譜分別檢測果糖和葡萄糖含量的前提是實現(xiàn)它們在液相部分的完全分離。本實驗中水和乙腈的比例為10∶90（V/V），這是因為實驗采用正相操作條件，此時水比乙腈的極性更強，由實驗經驗只有當流動相中乙腈體積分數(shù)大于50%時，才能保證色譜峰的峰形尖銳，避免色譜峰的展寬。實驗證明流動相選擇水-乙腈（10∶90，V/V），流速0.8 mL/min時果糖、葡萄糖峰形較好并實現(xiàn)了良好的分離，如圖1、2所示。

圖1 果糖和葡萄糖標準品的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of mixed standards of fructose and glucose

圖2 啤酒樣品1的總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatogram of beer sample 1

2.2 質譜條件的選擇

采用直接進樣方式分別將0.1 g/L的果糖、葡萄糖標準溶液各自進行正、負模式掃描，根據準分子離子峰確定選擇負離子掃描模式，得到葡萄糖、果糖的準分子離子。然后以選定的準分子離子為母離子進行二級質譜掃描，優(yōu)化質譜參數(shù)碎裂電壓和碰撞能量，使2種糖的定性離子與定量離子產生的離子對強度比例達到最大，從而得到果糖和葡萄糖的最佳質譜參數(shù)如表l所示。

2.3 線性范圍及檢出限

用體積分數(shù)90%乙腈水溶液逐級稀釋的果糖標準工作液（30、20、15、10、5、1.25 mg/L）和葡萄糖標準工作液（50、40、20、10、5、2 mg/L）分別進樣，以樣品的峰面積（Y）對質量濃度（X）進行線性回歸。如圖3所示，果糖的線性范圍為1.25～30 mg/L，線性相關系數(shù)R2=1；如圖4所示，葡萄糖的線性范圍為2～50 mg/L，線性相關系數(shù)R2=0.999 9。

圖3 果糖的標準曲線Fig.3 Calibration curve of fructose

圖4 葡萄糖的標準曲線Fig.4 Calibration curve of glucose

用空白水樣進行加標實驗，檢測信號以大于信噪比3 倍視為能夠檢出，將此添加量定為檢出限。按照上述步驟操作，進樣量為5 μL時，果糖的檢出限為0.05 mg/L，葡萄糖的檢出限為0.49 mg/L。

2.4 方法的精密度與回收實驗

選擇5 種不同的市售啤酒為測試樣品，分別編號1～5。樣品經0.22 μm濾膜過濾后直接上機測試，重復5 次實驗得到樣品中果糖和葡萄糖的含量，結果見表2。精確稱取4 mg果糖和8 mg葡萄糖標準品加入體積為1 L的5組樣品中，充分溶解后經0.22 μm濾膜過濾后直接上機測試，重復5次實驗得到該方法的加標回收結果。從表2可以看出，該方法具有良好的精密度和較高的準確性。

表2 啤酒樣品中果糖和葡萄糖含量檢測結果Table 2 Results of fructose and glucose in beer samples

3 結 論

本實驗采用超高效液相色譜-四極桿質譜聯(lián)用儀測定食品中微量的果糖和葡萄糖，并利用本方法對市售的5種啤酒中果糖、葡萄糖的含量進行了檢測。實驗結果表明，相較于傳統(tǒng)檢測手段本方法快速、靈敏、高效、準確，適用于快速測定食品中微量的果糖和葡萄糖含量。

[1]黃南方.啤酒質量識別及其營養(yǎng)價值[J].農牧產品開發(fā), 1999(4):36-38.

[2]鄭海鷹, 楊小蘭, 劉文娟, 等.啤酒營養(yǎng)與保健作用的研究進展[J].農產品加工, 2009(4): 17-20.

[3]馬乃良, 許思昭, 陳美洪, 等.食品中糖類的測定方法探討[J].現(xiàn)代食品科技, 2006, 28(6): 720-727.

[4]楊艷彬, 宋于洋, 顏海燕.葡萄酒中還原糖含量測定方法的研究[J].釀酒, 2000(6): 89-91.

[5]偰德翱.電位滴定法測定葡萄酒中還原糖含量的研究[J].食品工程,2007(3): 61-63.

[6]周雅璇, 果秀敏, 翟彤宇, 等.酶法測定酒中葡萄糖含量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2005, 15(2): 194.

[7]孫士青, 王寧, 何偉, 等.酶電極法測定葡萄糖注射液中葡萄糖含量的研究[J].中國藥學雜志, 1994, 29(9): 546-548.

[8]NIU Xiaoying, ZHAO Zhilei, JIA Kejun, et al.A feasibility study on quantitative analysis of glucose and fructose in lotus root powder by ft-nir spectroscopy and chemometrics[J].Food Chemistry, 2012, 133(2): 592-597.

[9]DI V E, SINELLI N, GIOVANELLI G, et al.NIR and MIR spectroscopy as rapid methods to monitor red wine fermentation[J].European Food Research and Technology, 2010, 230(6): 947-955.

[10]趙凱, 許鵬舉, 谷廣燁.3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究[J].食品科學, 2008, 29(8): 534-536.

[11]WAHJUDIA P N, PATTERSONB M E, LIMA S, et al.Measurement of glucose and fructose in clinical samples using gas chromatography/mass spectrometry[J].Clinical Biochemistry, 2010, 43(1): 198-207.

[12]林勤保, 蔣梅峰, 楊春.氣相色譜-質譜聯(lián)用法測定大棗低聚糖的單糖組成[J].食品科學, 2009, 30(16): 210-212.

[13]RUIZ-MATUTE AI, HERNáNDEZ-HERNáNDEZ O,RODRíGUEZ-SáNCHEZ S, et al.Derivatization of carbohydrates for GC and GC-MS analyses[J].Journal of Chromatography B, 2011,879(17/18): 1226-1240.

[14]張峻松, 宣曉泉, 唐綱嶺, 等.毛細管氣相色譜法測定煙草中葡萄糖、果糖、蔗糖的含量[J].中國煙草學, 2007, 13(2): 17-20.

[15]MA Chunmei, SUN Zhen, CHEN Changbao, et al.Simultaneous separation and determination of fructose, sorbitol, glucose and sucrose in fruits by HPLC-ELSD[J].Food Chemistry, 2014, 145(15): 784-788.

[16]SHANMUGAVELAN P, KIM S Y, KIM J B, et al.Evaluation of sugar content and composition in commonly consumed Korean vegetables, fruits, cereals, seed plants, and leaves by HPLC-ELSD[J].Carbohydrate Research, 2013, 380(18): 112-117.

[17]逯平杰, 代容春, 葉冰瑩, 等.高效液相色譜法測定甘蔗節(jié)間果糖、葡萄糖和蔗糖的含量[J].食品科學, 2011, 32(2): 198-200.

[18]劉玉峰, 李黎, 李東, 等.高效液相色譜法測定食品中的單糖, 雙糖[J].食品科學, 2007, 28(3): 293-296.

[19]張書芬, 史萍萍, 王全林, 等.液相色譜示差折光法測定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖[J].食品科學, 2008, 29(6): 280-283.

[20]莫海濤, 李永庫, 潘發(fā)用, 等.高效液相色譜-激光蒸發(fā)光散射檢測法測定低蔗糖食品中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖含量[J].食品工業(yè)科技, 2006, 27(3): 186-191.