董 琪，王 武，陳從貴，夏新武，金曉麗

（合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

發(fā)酵肉制品是畜禽肉在自然或人工條件下經(jīng)特定微生物發(fā)酵或酶的作用，進(jìn)行腌制、發(fā)酵、干燥或熏制，產(chǎn)生具有特殊風(fēng)味、色澤與質(zhì)地，且具有較長保存期的一類肉制品[1]。發(fā)酵肉制品具有營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特、保質(zhì)期長的特點(diǎn)。然而，傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品是自然發(fā)酵，受季節(jié)的限制，生產(chǎn)時(shí)間長，微生物種類較復(fù)雜，質(zhì)量不容易控制[2]。因此，越來越多的學(xué)者關(guān)注到在傳統(tǒng)工藝上改進(jìn)，通過篩選合適的發(fā)酵劑加入到肉制品中，快速發(fā)酵，并能得到較好的風(fēng)味，從而生產(chǎn)出更符合中國人口味的中式發(fā)酵肉制品。

近年，對于發(fā)酵肉制品的研究主要包括優(yōu)良的發(fā)酵菌種[3-6]、優(yōu)化發(fā)酵條件及改進(jìn)生產(chǎn)加工工藝[7-9]、減少發(fā)酵肉制品有害污染[10]及風(fēng)味[11-12]等方面。然而，發(fā)酵肉制品的風(fēng)味是決定其品質(zhì)的重要指標(biāo)。風(fēng)味物質(zhì)由揮發(fā)性和非揮發(fā)性的風(fēng)味化合物組成。針對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)常用的提取技術(shù)有機(jī)溶劑萃取、真空蒸餾、靜態(tài)頂空、動(dòng)態(tài)頂空、吹掃-冷阱捕集、超臨界萃取和固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）等，并結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀進(jìn)行分離和鑒定[13-19]。其中，SPME是現(xiàn)代提取風(fēng)味物質(zhì)主要的方法之一[20-25]。

固相微萃取法是20世紀(jì)90年代初興起的一項(xiàng)新穎的樣品前處理與富集方法，最先由加拿大Pawliszyn研究小組開發(fā)研究的[26]。該方法是在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來，可將采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣集于一體，并且具有操作時(shí)間短、溶劑與樣品用量少、重現(xiàn)性好、精度高、檢測限低等優(yōu)點(diǎn)[27-28]。

固相微萃取是待測物與涂層相互平衡的吸附過程，受多重因素的影響，如樣品基質(zhì)、萃取頭種類、離子強(qiáng)度、樣品解吸時(shí)間、萃取時(shí)間和溫度等[29]。

不同種類的發(fā)酵香腸有著不同的風(fēng)味，受到原料、發(fā)酵劑、發(fā)酵條件等因素的影響[30]。本實(shí)驗(yàn)通過添加3 種菌種于發(fā)酵牛肉腸中，采用SPME與GC-MS結(jié)合的方法分析其中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，并對萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，為開發(fā)新型風(fēng)味牛肉制品、研究發(fā)酵牛肉腸風(fēng)味提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：剔骨牛后腿瘦肉（冷卻保鮮，恒都牛肉）市購，－18 ℃凍藏，備用。

菌種：清酒乳桿菌清酒亞種（Lactobacillus sakeisubsp.Sakei，Ls）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，Pp）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus，Sx） 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏l(xiāng)0 g、酵母膏5 g、葡萄糖5 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸銨2 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、蒸餾水1 L、pH 6.8、121 ℃、滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SCION TQ氣質(zhì)聯(lián)用儀 德國布魯克公司；固相微萃取頭和57330U固相微萃取手柄 美國Supelco公司；LHS-150HC-恒溫恒濕箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

發(fā)酵菌種制備：將保存菌種在甘露醇鹽瓊脂（mannitol salt agar，MSA）液體培養(yǎng)基中活化后，離心（5 000 r/min，10 min），用無菌生理鹽水制成菌懸液備用。

發(fā)酵牛肉腸的制備：剔骨牛后腿瘦肉，休整后，絞成肉糜，加入菌種與輔料（菌種數(shù)量之比，Ls∶Pp∶Sx=1∶1∶1，菌種添加量107CFU/g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的食鹽，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%亞硝酸鈉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%葡萄糖，為了不影響發(fā)酵牛肉腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究，未加入香辛料），攪拌均勻，灌腸，發(fā)酵（30 ℃，相對濕度（90±3）%，48 h），成熟（65 ℃，6 h）。將發(fā)酵好的牛肉腸取適量后，分別切碎混勻搗成粉末狀備用。

1.3.2 萃取頭老化

首次使用的固相微萃取頭在溫度為270 ℃氣相色譜的進(jìn)樣口中進(jìn)行老化，直到無雜峰出現(xiàn)。

1.3.3 檢測方法

將萃取頭插到樣品瓶中，推出纖維頭，一定條件下萃取。萃取后在氣相色譜儀進(jìn)樣口，250 ℃解吸一定時(shí)間。解吸完成后抽回纖維頭，拔出萃取頭，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)，檢測不同條件對總峰面積的影響。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.32 mm，1 μm）；升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持1 min，以8 ℃/min上升至200 ℃，保持5 min；再以10 ℃/min上升至240 ℃，保持5 min。載氣為He氣，流速1 mL/min；恒壓40 kPa，不分流。

1.3.5 質(zhì)譜條件

電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；進(jìn)樣口溫度與接口溫度均為250 ℃，檢測溫度240 ℃；離子源溫度200 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z45～450。

1.3.6 化合物定性與定量

利用布魯克GC-MS solution工作站與NIST 11 library數(shù)據(jù)庫檢索，從而確定其化學(xué)成分；化合物相對百分含量按峰面積歸一化計(jì)算，并應(yīng)用Excel軟件分析處理數(shù)據(jù)。

1.3.7 單因素試驗(yàn)

在固定發(fā)酵牛肉腸樣品量2 g、萃取溫度55 ℃、萃取時(shí)間50 min、解吸時(shí)間2 min條件下，研究萃取頭的種類對萃取效果的影響，分別選用DVB/CAR/PDMS、PDMS/DVB、CAR/PDMS 3 種萃取頭；萃取頭取上述最佳水平，在固定發(fā)酵牛肉腸樣品量2 g、萃取溫度55 ℃、解吸時(shí)間2 min條件下，研究萃取時(shí)間對萃取效果的影響，因素水平選取為30、40、50、60 min；萃取時(shí)間取上述最佳水平，在固定發(fā)酵牛肉腸萃取頭為DVB/CAR/PDMS、樣品量2 g、解吸時(shí)間2 min條件下，研究萃取溫度對萃取效果的影響，因素水平選取為45、55、65、75 ℃；萃取時(shí)間取上述最佳水平，在固定發(fā)酵牛肉腸萃取頭為DVB/CAR/PDMS、萃取溫度65 ℃、解吸時(shí)間2 min條件下，研究樣品量對萃取效果的影響，因素水平選取為1、2、3、4 g；樣品量取上述最佳水平，在固定發(fā)酵牛肉腸萃取頭為DVB/CAR/PDMS、萃取溫度65 ℃、萃取時(shí)間50 min條件下，研究解吸時(shí)間對萃取效果的影響，因素水平選取為1、2、3、4 min。

1.3.8 萃取條件的優(yōu)化

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇DVB/CAR/PDMS萃取頭，解吸時(shí)間固定為2 min，以發(fā)酵牛肉腸的樣品量、萃取時(shí)間及萃取溫度作為3個(gè)影響因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化工藝參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 萃取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array experiments on extraction conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取頭種類對萃取效果的影響

圖1 萃取頭種類對萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction fiber type on the identification of volatile compounds

如圖1所示，DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取的總峰面積和風(fēng)味化合物種類都遠(yuǎn)大于PDMS/DVB萃取頭和PDMS萃取頭，故萃取頭類型選擇DVB/CAR/PDMS。

2.1.2 萃取時(shí)間對萃取效果的影響

圖2 萃取時(shí)間對萃取效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on the identi fication of volatile compounds

萃取時(shí)間對發(fā)酵牛肉腸揮發(fā)性化合物萃取效果的影響如圖2所示，隨著萃取時(shí)間的延長，檢測到的總峰面積和風(fēng)味化合物總數(shù)不斷增大，50 min后，總峰面積達(dá)到平穩(wěn)，但風(fēng)味化合物總數(shù)有所減少，可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長，部分風(fēng)味物質(zhì)從萃取纖維頭脫附。故萃取時(shí)間定為50 min。

2.1.3 萃取溫度對萃取效果的影響

如圖3所示，隨著溫度的升高，總峰面積和風(fēng)味物質(zhì)總數(shù)呈先增加后減少的趨勢，都在65 ℃時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)闇囟壬?，有利于芳香物質(zhì)的揮發(fā)，但溫度過高也可能會(huì)使一些低沸點(diǎn)的物質(zhì)從萃取頭上解吸下來。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇萃取溫度為65 ℃。

圖3 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the identi fication of volatile compounds

2.1.4 樣品萃取量對萃取效果的影響

圖4 樣品量對萃取效果的影響Fig.4 Effect of sample amount on the identi fication of volatile compounds

如圖4所示，隨著發(fā)酵牛肉腸樣品量的增加，總峰面積和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總數(shù)呈現(xiàn)先增加而減小的趨勢，當(dāng)萃取量為2 g達(dá)到最大。因此，萃取量為2 g時(shí)較好。

2.1.5 解吸時(shí)間對萃取效果的影響

圖5 解吸時(shí)間對萃取效果的影響Fig.5 Effect of desorption times on the identi fication of volatile compounds

如圖5所示，隨著解吸時(shí)間的延長，總峰面積和風(fēng)味化合物總數(shù)先增大，在解吸時(shí)間為2 min之后二者基本不變，故本實(shí)驗(yàn)選取解吸時(shí)間為2 min。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表2為正交試驗(yàn)的結(jié)果與分析，由直接分析可知最佳組合條件為9號方案。極差分析可知，以總峰面積作為萃取效果的指標(biāo)而言，因素主次為CBA，最優(yōu)水平組合為C2B3A3。以風(fēng)味物質(zhì)總數(shù)為指標(biāo)而言，因素主次為CAB，最優(yōu)水平組合為C2A3B3。因此，對于不同的指標(biāo)而言，因素影響的主次順序是不一樣的，而風(fēng)味物質(zhì)總數(shù)指標(biāo)來說A和B兩因素的極差相差不大，對于總峰面積來說A與B的極差要差很多，因此經(jīng)綜合考慮兩個(gè)因素對兩個(gè)指標(biāo)影響的主次順序?yàn)镃BA，最優(yōu)組合為C2B3A3。直接分析與極差分析結(jié)果一致。因此，確定固相微萃取法萃取發(fā)酵牛肉腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)最佳萃取條件為：DVB/CAR/PDMS萃取頭、萃取時(shí)間60 min、萃取溫度為65 ℃、萃取量為3 g、解吸時(shí)間為2 min。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal array experiments

2.3 發(fā)酵牛肉腸揮發(fā)性成分的檢測

根據(jù)上述優(yōu)化后的萃取條件，對發(fā)酵牛肉腸揮發(fā)性化合物進(jìn)行萃取，其發(fā)酵牛肉腸中揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS色譜圖如圖6所示。風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果見表3。

圖6 發(fā)酵牛肉腸中揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖Fig.6 Total ion chromatogram of volatile compounds in fermented beef sausage

發(fā)酵牛肉腸中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果見表3。由表3可知，發(fā)酵牛肉腸中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要為：醛類17 種，占64.72%；酮類9 種，占4.18%；醇類23 種，占12.29%；酸類7 種，占4.24%；烴類16 種，占4.18%；雜環(huán)類10 種，占4.29%；酯類3 種，占0.81%；其他有3 種，占1.27%。

表3 發(fā)酵牛肉腸SPME-GC-MS分析結(jié)果Table 3 Results for fermented beef sausage from SPME-GC-MS

續(xù)表3

3 結(jié) 論

利用單因素結(jié)合多因素的試驗(yàn)方法研究了固相微萃取的萃取頭的種類、樣品萃取量、萃取溫度、萃取時(shí)間以及解吸時(shí)間對發(fā)酵牛肉腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分萃取效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)使用 DVB/CAR/PDMS萃取頭、萃取時(shí)間60 min、萃取溫度65 ℃、樣品萃取量3 g、解吸時(shí)間為2 min時(shí)，萃取效果較好。確定發(fā)酵牛肉腸中的主要風(fēng)味物質(zhì)為：醛類17 種（64.72%）；酮類9 種（4.18%）；醇類23 種（12.29%）；酸類7 種（4.24%）；烴類16 種（4.18%）；雜環(huán)類10 種(4.29%)；酯類3 種(0.81%)；其他有3 種（1.27%）。

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