李次力，劉 暢，劉天怡，金瑱琪，侯 靜

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

馬鈴薯，別名土豆、洋芋，植物馬鈴薯是茄科茄屬一年生草本。其塊莖可供食用，是重要的糧食、蔬菜兼用作物，是世界四大糧食作物之一[1]。馬鈴薯具有豐富的營養(yǎng)，一般新鮮馬鈴薯中所含成分：淀粉9%～20%，脂肪0.1%～1.1%，粗纖維0.6%～0.8%。100 g馬鈴薯中所含的營養(yǎng)成分：熱量66～113 J，鈣11～60 mg，磷15～68 mg，鐵0.4～4.8 mg，硫胺素0.03～0.07 mg，核黃素0.03～0.11 mg，尼克酸0.4～1.1 mg等。除此以外，馬鈴薯塊莖還含有禾谷類糧食所沒有的胡蘿卜素和抗壞血酸[2-4]。

馬鈴薯鮮薯可供燒煮作為糧食或蔬菜。世界各國生產(chǎn)的馬鈴薯加工食品，如法式凍炸條、炸片、速溶全粉以及花樣繁多的糕點(diǎn)、蛋卷等，為數(shù)達(dá)100多種[5-6]。對(duì)于加工馬鈴薯后的皮，作為廢物丟棄。而馬鈴薯可作為抗衰老食物，是由于其中所含的酚類物質(zhì)具有保健作用[7-8]。馬鈴薯塊莖中總酚含量以干質(zhì)量計(jì)在0.11%～0.13%之間，芽中含量高達(dá)0.18%，其中約90%是綠原酸[9]。酚類物質(zhì)主要存在于馬鈴薯的皮和皮層之間，約有50%存在于皮及鄰近的組織中，越靠近塊莖的中心，濃度越低[10-11]。

綠原酸（chlorogenicacid）是由咖啡酸（caffeic acid）與奎尼酸（quhaoacid）組成的縮酚酸，異名咖啡靴酸，化學(xué)名3-O-咖啡酞奎尼酸（3-O-caffeoylquinic acid），是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物[12]。綠原酸是食品、藥品、化妝品等工業(yè)的重要原料。綠原酸具有廣泛的生物活性，對(duì)自由基的清除和抗脂質(zhì)過氧化作用顯著，具有抗菌、抗病毒、抗誘變、保肝、利膽等多種藥用功能[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)嘗試將對(duì)馬鈴薯鮮薯皮提取綠原酸并研究其功能性質(zhì)，以期為充分利用我國馬鈴薯的資源優(yōu)勢(shì)、加快馬鈴薯及其副產(chǎn)物的深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯皮 麥肯食品（哈爾濱）有限公司。

無水乙醇、H2O2、抗壞血酸、KClO3均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ALC-3100.2型電子天平 上海奕宇電子科技有限公司；DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FW177型粉碎機(jī) 南京萊步科技鄭州有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋 蘇州江東精密儀器有限公司；752型紫外-可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；LC-20AB島津高效液相色譜儀 杭州瑞析科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將馬鈴薯皮洗凈，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中80 ℃干燥，取出后用粉碎機(jī)粉碎成粉末，過40 目篩放入瓶中密封備用。

1.3.2 綠原酸的測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

用天平準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.005 g，用70%乙醇溶液溶解定容于100 mL的質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液，搖勻，備用。

分別準(zhǔn)確量取上述0.05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，70%乙醇溶液定容至10 mL，以空白試劑為對(duì)照，327 nm波長處測(cè)定吸光度，以綠原酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖[15]。綠原酸得率按式（1）計(jì)算：

式中：Y為綠原酸得率/（mg/g）；m1為綠原酸的質(zhì)量/mg；m0為原料馬鈴薯皮粉的質(zhì)量/g。

1.3.2.2 馬鈴薯皮中綠原酸的提取方法

采用乙醇回流提取法，提取方法如下：將索氏提取器的各部位充分洗滌并用蒸餾水清洗后烘干，然后將含有樣品的濾紙筒放入索氏提取器的抽提筒內(nèi)，連接已干燥至恒質(zhì)量的脂肪燒瓶，由提取器冷凝管上端加入乙醇至瓶內(nèi)容積的2/3處，通入冷凝水，將底瓶浸沒在水浴中加熱，用一小團(tuán)脫脂棉輕輕塞入冷凝管上口。抽提完畢，回收乙醇，然后稱質(zhì)量[16-17]。

1.3.3 乙醇回流法提取綠原酸的條件優(yōu)化

1.3.3.1 料液比的選擇

取12 g馬鈴薯皮干粉放入濾紙筒內(nèi)，然后分別取馬鈴薯皮干粉與乙醇之間的料液比為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18（g/mL）進(jìn)行乙醇回流提取實(shí)驗(yàn)，75%乙醇溶液，95 ℃水浴，回流3 次，提取完成后，進(jìn)行回收乙醇，最后將所得提取液分別定容至20 mL，然后以75%的乙醇溶液作為空白對(duì)照，放入紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行綠原酸含量測(cè)定。

1.3.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

分別配制70%、75%、80%、85%、90%的乙醇溶液，取12 g馬鈴薯皮干粉，料液比1∶12、95 ℃水浴，回流3 次，提取完成后，進(jìn)行回收乙醇，最后將所得提取液分別定容至20 mL，然后分別以75%、80%、85%、90%的乙醇溶液作為空白對(duì)照，放入紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行綠原酸含量的測(cè)定。

1.3.3.3 提取溫度的選擇

分別設(shè)定91、93、95、97、99 ℃的提取溫度，取12 g馬鈴薯皮干粉，料液比1∶12、80%乙醇溶液，回流3 次提取完成后，進(jìn)行回收乙醇，最后將所得提取液分別定容至20 mL，以85%乙醇溶液作為空白對(duì)照，放入紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行綠原酸含量的測(cè)定。

1.3.3.4 回流次數(shù)的選擇

取12 g馬鈴薯皮干粉放入濾紙筒內(nèi)，料液比為1∶12、80%乙醇溶液、95 ℃水浴，分別回流1、2、3、4、5 次進(jìn)行乙醇回流提取實(shí)驗(yàn)，提取完成后，進(jìn)行回收乙醇，最后將所得提取液分別定容至20 mL，然后以85%的乙醇溶液作為空白對(duì)照，放入紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行綠原酸含量的測(cè)定。

1.3.4 綠原酸提取正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定因素水平，以料液比A、乙醇體積分?jǐn)?shù)B、提取溫度C、回流次數(shù)D為因素，設(shè)計(jì)四因素三水平L9（34），進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化組合。所選水平如表1所示。

表1 馬鈴薯皮中提取綠原酸正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design for the extraction of chlorogenic acid from potato peel

1.3.5 高效液相色譜法鑒定綠原酸[18-19]

分析條件：L a b C18分析柱：（2 5 0 m m×4.5 m m），流動(dòng)相為乙腈∶檸檬酸緩沖溶液∶水（10∶20∶70，V/V），流速為1.0 mL/min，室溫，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長為324 nm。

利用高效液相色譜在相同色譜條件下，將標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖與樣品色譜圖進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中的綠原酸。

1.3.6 綠原酸的抗氧化性分析

1.3.6.1 綠原酸對(duì)DPPH自由基的清除作用

配制濃度為20 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液保存于棕色瓶中（臨用前現(xiàn)配）。向比色管中加入2.0 mL DPPH自由基乙醇溶液，2.0 mL不同質(zhì)量濃度馬鈴薯綠原酸提取物，搖勻，室溫條件下避光靜置30 min，然后在517 nm波長處測(cè)定吸光度A1；用等體積乙醇代替樣品，測(cè)定吸光度A0；以VC作為陽性對(duì)照品，以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，制作樣品質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率關(guān)系曲線[20-21]。按照式（2）計(jì)算清除率：

1.3.6.2 綠原酸對(duì)羥自由基的清除作用

將8 mmol/L的FeSO4溶液0.5 mL，6 mmol/L的H2O2溶液0.8 mL，蒸餾水0.5 mL，不同質(zhì)量濃度的馬鈴薯綠原酸提取物1.0 mL，20 mmol/L水楊酸鈉溶液0.2 mL混合，搖勻，置于37 ℃水浴中1 h，然后于562 nm波長處測(cè)定混合物吸光度A1；用等體積的蒸餾水代替樣品溶液，其余不變，測(cè)定吸光度A0；以VC為陽性對(duì)照，相同方法進(jìn)行測(cè)定[22-23]。按照式（3）計(jì)算馬鈴薯綠原酸提取物及VC對(duì)羥自由基的清除率：

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，得出綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=67.4x＋0.001 4（相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6），可見，綠原酸在0.001～0.005 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 提取綠原酸的單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)綠原酸得率的影響

圖1 料液比對(duì)綠原酸得率的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of chlorogenic acid

由圖1可以看出，綠原酸得率隨提取液用量的增加而增大，當(dāng)料液比為1∶12時(shí)，提取效果最佳，再增大提取液用量時(shí)，綠原酸的得率增長趨勢(shì)平緩，說明馬鈴薯皮組織內(nèi)的絕大部分綠原酸已浸出。有機(jī)溶劑與水的混合液可打斷馬鈴薯酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)的結(jié)合鍵，有利于其酚類物質(zhì)的浸提。所以隨著提取液用量的增加馬鈴薯酚類物質(zhì)浸提率也增加；但當(dāng)提取液用量增加到一定比例時(shí)，浸提率將趨于穩(wěn)定[24]。從生產(chǎn)成本和提取效果兩方面綜合考慮，適宜的料液比為1∶12。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸得率的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of chlorogenic acid

由圖2可以看出，綠原酸得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高，在乙醇體積分80%時(shí)，提取效果最佳，但當(dāng)大于80%時(shí)，得率下降。隨著浸提時(shí)間的延長，馬鈴薯皮與溶劑充分接觸，因而綠原酸得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，但是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過大時(shí)，由于乙醇本身的特性，馬鈴薯皮組織內(nèi)的一些綠原酸不易被高體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取，所以使得綠原酸的得率反而有所降低。所以提取綠原酸最適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.2.3 提取溫度對(duì)綠原酸得率的影響

圖3 提取溫度對(duì)綠原酸得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of chlorogenic acid

由圖3可以看出，綠原酸得率隨著提取溫度的升高而升高，但是當(dāng)達(dá)到95 ℃左右后又開始下降。綠原酸易溶于水，但當(dāng)溫度降低時(shí)，溶解性變差，所以溫度太低不利綠原酸的溶出，隨著溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)速率加快，馬鈴薯皮與乙醇的傳質(zhì)作用加強(qiáng)[25]，但綠原酸不穩(wěn)定，當(dāng)溫度過高時(shí)，會(huì)加速綠原酸的分解，并使其有效成分被破壞，綠原酸失活，使綠原酸的得率降低[26]。所以最適宜的提取溫度為95 ℃。

2.2.4 回流次數(shù)對(duì)綠原酸得率的影響

由圖4可以看出，綠原酸得率隨著回流次數(shù)的增加而增大，當(dāng)回流次數(shù)大于3 次時(shí)，綠原酸的得率變化不大，這可能是因?yàn)榛亓鞔螖?shù)過少，馬鈴薯皮中的綠原酸未能充分溶出，隨著回流次數(shù)的增加，綠原酸逐漸溶解到溶劑中，考慮到回流次數(shù)過多，溶劑的消耗量增大，所以最適宜的提取回流次數(shù)為3 次。

圖4 回流次數(shù)對(duì)綠原酸得率的影響Fig.4 Effect of number of repeated extractions on the extraction yield of chlorogenic acid

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化綠原酸提取的最佳條件

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

由表2、3可得，各因素對(duì)綠原酸得率的影響程度依次為C＞D＞B＞A，其中C為主要因素，D、B、A為次要因素，綜上所述，A1B3C3D2為最佳提取工藝條件，即料液比1∶10、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取溫度97 ℃、回流3 次時(shí)，綠原酸得率最高，提取物經(jīng)冷凍干燥得馬鈴薯皮綠原酸提取物粉末[17]。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按正交試驗(yàn)確定的最佳提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，綠原酸得率為2.229 mg/g，表明此正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)組是符合實(shí)際的。

2.5 高效液相色譜法鑒定綠原酸

對(duì)馬鈴薯皮提取液中是否含有綠原酸進(jìn)行定性分析，標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖如圖5所示，樣品則選取了70%乙醇提取液進(jìn)行譜圖繪制，見圖6。根據(jù)圖5、6表明檢測(cè)物均在10.211 min處出現(xiàn)最大吸收峰，可以初步斷定兩種物質(zhì)為同一化合物。

圖5 高效液相色譜綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of standard chlorogenic acid solution

圖6 70%乙醇馬鈴薯皮提取液色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of 70% ethanol extract from potato peel

2.6 綠原酸的抗氧化性

2.6.1 馬鈴薯綠原酸對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖7 綠原酸及VC對(duì)DPPH自由基清除的作用Fig.7 DPPH radical scavenging activities of chlorogenic acid and ascorbic acid

如圖7所示，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VC、綠原酸對(duì)DPPH自由基的清除作用隨質(zhì)量濃度升高逐漸增強(qiáng)，達(dá)到0.06 mg/mL后，清除率上升緩慢，質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，樣品對(duì)DPPH自由基清除率最大，達(dá)到85.13%，VC達(dá)到90.12%。由此可以看出，綠原酸對(duì)DPPH自由基的清除作用與VC對(duì)其的清除作用相差不大，表明綠原酸具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

2.6.2 綠原酸對(duì)羥自由基的清除作用

圖8 綠原酸及VC對(duì)羥自由基的清除作用Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activities of chlorogenic acid and ascorbic acid

圖8結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.02～0.5 mg/mL），綠原酸與VC對(duì)羥自由基表現(xiàn)出一定的抑制作用，并隨著質(zhì)量濃度的增加，清除率增大，當(dāng)綠原酸質(zhì)量濃度達(dá)到0.3 mg/mL后，清除率增加緩慢，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，綠原酸對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到最大，為43.14%，VC對(duì)羥自由基的清除率為55.26%，表明綠原酸對(duì)羥自由基有一定的清除作用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以馬鈴薯皮為原料，應(yīng)用乙醇回流法提取其中的抗氧化物質(zhì)綠原酸，采用單因素和正交試驗(yàn)來確定提取綠原酸得率的最佳工藝條件，并且將其應(yīng)用到油脂中測(cè)其抗氧化效果。得到以下結(jié)論：1）料液比1∶10、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取溫度97℃、回流3次時(shí)馬鈴薯皮中綠原酸得率最高，即提取綠原酸的最優(yōu)組合條件為A1B3C3D2。其中，對(duì)于綠原酸得率影響最大的因素是提取溫度。2）綠原酸對(duì)于DPPH自由基、羥自由基有一定的清除作用，從而可以得知，本實(shí)驗(yàn)從馬鈴薯皮中提取的綠原酸具有一定的抗氧化性，證實(shí)了馬鈴薯皮中的確含有抗氧化物值得利用生產(chǎn)。

[1]陳芳, 趙景文, 胡小松.我國馬鈴薯加工業(yè)的現(xiàn)狀、問題及發(fā)展對(duì)策[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2002, 4(2): 66-68.

[2]呂巨智, 染和, 姜建初.馬鈴薯的營養(yǎng)成分及保健價(jià)值[J].中國食物與營養(yǎng), 2009, 15(3): 51-52.

[3]劉素穩(wěn), 張澤生, 楊海延, 等.馬鈴薯蛋白的營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào), 2008(2): 208-209.

[4]李勤志.中國馬鈴薯生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)分析[D].武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[5]趙萍, 李春雷, 張軼, 等.馬鈴薯生產(chǎn)加工現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].甘肅工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 29(1): 76-78.

[6]王秀芳.荷蘭的馬鈴薯加工業(yè)[J].世界農(nóng)業(yè), 1998(4): 24.

[7]宋立江, 狄瑩, 石碧.植物多酚研究與利用的意義及發(fā)展趨勢(shì)[J].化學(xué)進(jìn)展, 2000, 12(2): 161-170.

[8]馮麗, 宋曙輝, 趙霖, 等.植物多酚種類及其生理功能的研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2007, 19(10): 105-107.

[9]吳文標(biāo), 盛德賢, 呂世安, 等.馬鈴薯酚類化合物的研究[J].中國馬鈴薯, 2001, 15(3): 158-161.

[10]REEVE R M, HAUTALA E, WEARER M L.Anatomy and compositional variation within the potatoes.2.Phenolics, enzymes and other minor components[J].American Potato Journal, 1969, 46(10): 374-386.

[11]HASEGAWA D, JOHNSON R M, GOULD W A.Effect of cold storage on chlorogenic acid content of potatoes[J].Journal Agricultural Food Chemistry, 1966, 14: 165-169.

[12]徐躍成.金銀花中綠原酸的提取分離及其抑菌作用研究[D].重慶:重慶大學(xué), 2008.

[13]常翠青, 陳吉棣, 王香生.有機(jī)酸對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2001, 35(2): 79-82.

[14]吳紅, 李穩(wěn)室, 吳道澄, 等.杜仲葉中綠原酸測(cè)定方法的比較[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 24(1): 78.

[15]高歧, 竇憲民.微波法提取葵花籽仁中的綠原酸[J].中國油脂, 2009,34(6): 68-69.

[16]劉剛, 張雁南, 蘇偉, 等.葵花粕中綠原酸的提取及其抗氧化研究[J].長春師范學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2011, 30(6): 52-57.

[17]劉冠明, 朱麗琴, 余土元, 等.金銀花中綠原酸乙醇回流提取的條件優(yōu)化研究[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù), 2005, 25(3): 75-76

[18]烏蘭, 張澤生.金銀花中綠原酸的提取及檢測(cè)[J].食品科學(xué), 2005,26(6): 130-134.

[19]張建華, 金黎平, 謝開云, 等.高效液相色譜法測(cè)定馬鈴薯塊莖的綠原酸含量[J].食品科學(xué), 2007, 28(5): 301-304.

[20]張澤生, 烏蘭.金銀花中綠原酸的體外抑菌和抗氧化性的研究[J].天津科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 20(2): 5-8.

[21]金杰, 李志西, 張鋒, 等.桑椹醋提取物對(duì)二苯代苦味酰基自由基DPPH的清除作用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 34(3):135-137.

[22]魏行, 程明, 馮睿, 等.堿溶性菜籽多糖的提取條件優(yōu)化及體外抗氧化活性研究[J].食品科學(xué), 2007, 28(8): 195-198.

[23]馮慧萍, 李亦聰.羥自由基與水楊酸反應(yīng)機(jī)理的初探[J].光譜實(shí)驗(yàn)室, 2009, 26(4): 934-938.

[24]周勝男.馬鈴薯中酚類物質(zhì)的提取、純化及檢測(cè)方法研究[D].合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[25]何鋼, 劉賢桂, 李樊, 等.金銀花葉片綠原酸提取及工藝參數(shù)優(yōu)化的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 30(1): 136-143.

[26]杜延兵, 裘愛泳, 逯昕.葵花粕中綠原酸提取工藝的研究[J].中國油脂, 2006, 31(2): 38.