王 微，闞建全,2,3,

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400715；3.農業(yè)部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

鲊辣椒是川、鄂、湘、黔等地區(qū)的一種傳統(tǒng)特色食品，是以新鮮的紅辣椒和玉米粉為主要原料，加一定的輔料拌合后自然發(fā)酵而成，成品微酸微辣、香氣特殊、回味醇厚，保存期相對較長。鲊辣椒又稱鲊金椒，鲊海椒、鲊廣椒，是鲊菜之母，既可單獨成菜，也可用其作為原料加工成許多鲊菜。因其獨特風味和口感，并具有較高營養(yǎng)價值等而廣受大眾喜愛。但目前鲊辣椒的傳統(tǒng)制作方法是自然發(fā)酵[1]，具有發(fā)酵條件穩(wěn)定性差，生產發(fā)酵周期長，產品品質不穩(wěn)定、安全性低，且沒有工業(yè)化大規(guī)模生產。因此，鲊辣椒純種發(fā)酵技術則可以改善傳統(tǒng)發(fā)酵的很多弊端，使產品更安全[2]、更美味、更營養(yǎng)及生產更規(guī)?；?，品質和產量均更符合人們的需求。在鲊辣椒純種發(fā)酵的過程中，菌種的選擇、菌種的接種量、發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度、原料的配比等都是純菌接種快速發(fā)酵技術成功的關鍵[3-5]。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠通過同型發(fā)酵或者異型發(fā)酵而產生乳酸的細菌[6]，是蔬菜發(fā)酵中較為重要的一種細菌，最近有研究顯示乳酸菌還能夠加強特異性及非特異性免疫[7-8]，目前乳酸菌已廣泛應用于食品發(fā)酵、工業(yè)乳酸發(fā)酵以及醫(yī)療保健領域[9]。因此，本實驗在前期研究的基礎上，利用乳酸菌作為發(fā)酵菌，并采用響應面法對其純種發(fā)酵工藝參數進行優(yōu)化，旨在探討影響鲊辣椒純種發(fā)酵的各因素，為鲊辣椒純種發(fā)酵技術工業(yè)化提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅辣椒（紅線椒）、干玉米粉（過40目篩）、食鹽 重慶永輝超市；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum6001） 中國科學院菌種保藏中心。

氫氧化鈉（分析純） 天津市瑞金特化學品有限公司；甲醛、3,5-二硝基水楊酸、亞硝酸鈉等（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠；硝酸銀（分析純）天津光復科技發(fā)展有限公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂等（均為生物試劑） 北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；722-P可見分光光度計 上?，F科儀器有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；PB-10 Sartorius酸度計 賽多利斯科學儀器有限公司；分析天平 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵菌懸液的制備

發(fā)酵菌液的制備[10-11]：取乳酸菌保藏菌種2環(huán)于斜面（MRS培養(yǎng)基）活化48 h，再取2環(huán)于MRS液體培養(yǎng)基中再活化48 h后接入500 mL液體MRS培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)乳酸菌發(fā)酵液（冷藏保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3.2 純種發(fā)酵鲊辣椒的單因素試驗

1.3.2.1 發(fā)酵溫度對鲊辣椒品質的影響研究

固定m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）＝1∶1、食鹽添加量5%、菌懸液接種量5%，混合拌料后置于密閉的容器中分別在23、25、30、35、40、42℃條件下恒溫發(fā)酵5 d。然后測定成品的pH值、總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量和感官評分。

1.3.2.2 接種量對鲊辣椒品質的影響研究

將m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）＝1∶1、發(fā)酵溫度30℃、食鹽添加量5%，混合拌料后置于密閉的容器中分別在1%、3%、5%、7%、9%、10%乳酸菌菌懸液接種量下恒溫發(fā)酵5 d。然后測定成品的pH值、總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量和感官評分。

1.3.2.3 發(fā)酵時間對鲊辣椒品質的影響研究

將m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）＝1∶1、發(fā)酵溫度30℃、食鹽添加量和菌懸液接種量5%，混合拌料后置于密閉的容器中分別在發(fā)酵2、3、4、5、6、7 d。然后測定成品的pH值、總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量和感官評分。

1.3.2.4 原料配比對鲊辣椒品質的影響研究

將m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）分別為3∶1、2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶2、1∶3，食鹽添加量5%，菌懸液接種量5%，發(fā)酵溫度30℃，混合拌料后置于密閉的容器中恒溫發(fā)酵5 d。然后測定成品的pH值、總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量和感官評分。

1.3.2.5 鹽添加量對鲊辣椒品質的影響研究

將m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）＝1∶1、菌懸液接種量5%、發(fā)酵溫度30℃，混合拌料后置于密閉的容器中分別在1%、3%、5%、6%、8%、10%食鹽添加量下恒溫發(fā)酵5 d。然后測定成品的pH值、總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量和感官評分。

1.3.3 鲊辣椒純種發(fā)酵工藝條件的響應面優(yōu)化試驗研究

響應面優(yōu)化試驗采用Design Expert 7.0.0軟件Box-Behnken中心組合原理進行設計。根據單因素試驗結果，選取發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時間、m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）以及食鹽添加量作為5個主要影響因素，以總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量、感官評分為相應評價值設計響應面優(yōu)化試驗[12-14]，對鲊辣椒純種發(fā)酵工藝條件參數進行優(yōu)化試驗研究。

1.3.4 理化指標的測定

pH值測定[15]：采用pH計測定；總酸含量測定[16]：中和滴定法；氨基酸態(tài)氮含量測定[17]：甲醛滴定法。

1.3.5 感官評價

采用100分制[18]，請10位有經驗的食品專家和10位消費者（非專業(yè)人員）按感官評分標準對成熟鲊辣椒樣品進行評分，取平均分作為最終評分。

表1 鲊辣椒的感官評定標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of preserved pepper

1.4 數據處理

實驗重復3次，并采用OriginLab Origin Pro v7.5軟件進行數據統(tǒng)計分析和制圖。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵工藝條件的單因素試驗結果

2.1.1 發(fā)酵溫度對鲊辣椒發(fā)酵的影響

由表2可見，從23 ℃開始，隨著發(fā)酵溫度增加產酸量和氨基酸態(tài)氮含量都是先增加，35 ℃以后則開始減少，感官評分也表現為先增加后降低的趨勢?？偹岷浚ㄒ匀樗嵊嫞┰?5 ℃時含量最高為1.07%，和30 ℃時的1.02%較接近，其他溫度下的總酸含量都＜0.81%。可見，溫度過低或過高均不利于鲊辣椒的乳酸形成。氨基酸態(tài)氮的含量在30 ℃時最高為0.28%，同時，此時的感官評分也最高為91.42分。

表2 發(fā)酵溫度對鲊辣椒發(fā)酵的影響Table 2 Effect of fermentation temperature on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

2.1.2 接種量對鲊辣椒發(fā)酵的影響

表3 接種量對鲊辣椒發(fā)酵的影響Table 3 Effect of inoculum quantity on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

由表3可見，當接種量從1%到10%遞增，pH值是逐漸降低的，較明顯變化的是1%、3%和5%。接種量＞5%后隨著接種量增加，pH值略降低，但是不顯著。鲊辣椒的總酸含量、氨基酸態(tài)氮的含量也隨著接種量的增加而增加，當接種量達到5%后，其增長量很小，甚至總酸的含量有略微下降的趨勢；這說明并不是接種量越多鲊辣椒發(fā)酵越好。

2.1.3 發(fā)酵時間對鲊辣椒發(fā)酵的影響

表4 發(fā)酵時間對鲊辣椒發(fā)酵的影響Table 4 Effect of fermentation time on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

由表4可知，隨著發(fā)酵時間的增加，鲊辣椒的氨基酸態(tài)氮含量、總酸含量逐漸升高、pH值逐漸下降；當發(fā)酵時間達到第4天時，鲊辣椒總酸含量為1.09%，pH值為4.25，之后的鲊辣椒的總酸量增長就十分緩慢并趨于平緩。發(fā)酵到第7天時，鲊辣椒的總酸含量和pH值與第4天的變化仍不明顯。

2.1.4 原料配比對鲊辣椒品質的影響

表5 原料配比對鲊辣椒發(fā)酵的影響Table 5 Effect of mass ratio of chili pepper to corn flour on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

由表5可知，鲊辣椒所占的比例越多，發(fā)酵產酸量越多；當鲊辣椒與玉米質量比達到3∶1時，總酸含量為1.67%，此時氨基酸態(tài)氮含量為0.20%，感官評分為80.79。雖然產酸較多，但是氨基酸態(tài)氮含量仍然較低；并且由于鲊辣椒比例大，水分過多，鲊辣椒的外觀和組織評分較低，以及過高的酸度，使之總體的感官評分較低。當鲊辣椒與玉米質量比1∶3時，總酸含量0.49%、氨基酸態(tài)氮含量0.15%和感官評分80.46，此時的鲊辣椒各個指標都處于較低的值，不易被消費者接受。

2.1.5 食鹽添加量對鲊辣椒品質的影響

表6 食鹽添加量對鲊辣椒發(fā)酵的影響Table 6 Effect of salt content on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

由表6可知，隨著食鹽添加量的增加，pH值呈逐漸上升趨勢、同時總酸含量呈逐漸降低的趨勢。由于食鹽添加量越多，對發(fā)酵菌的抑制作用越強，故其發(fā)酵產酸則越少。當食鹽添加量為1%時總酸含量為1.42%，但是感官評分為85.67則較低；此時的鹽添加量過少，鲊辣椒的咸度較低，口感上能接受，但不是較適合的口感。當食鹽添加量為3%和5%時，感官評分均較高為89.42和89.03，此時的鲊辣椒咸度正適合于人們咸度喜好程度；而之后的食鹽添加量為7%、8%和10%時的感官評分則更低。

2.2 鲊辣椒純種發(fā)酵工藝條件的響應面優(yōu)化試驗

根據單因素試驗結果，利用Design Expert軟件采用Box-Behnken中心組合原理設計建立數學模型[19]。其試驗設計及方案選取見表7。

2.2.1 純種發(fā)酵條件對鲊辣椒總酸含量的影響

以鲊辣椒的總酸（Y1）為響應值，建立鲊辣椒發(fā)酵工藝參數回歸模型?；貧w方程為：

表8 總酸含量的回歸模型方差分析Table 8 Analysis of variance for the regression model for total acid content

對模型（1）進行方差分析。由表8可知，F模型=21.01，P＜0.000 1，表明模型（1）極顯著，因變量與所考察自變量之間的線性關系顯著（R2=0.943 9），模型調整復相關系數=0.898 9，說明該模型能解釋90%以上響應值的變化，失擬項P=0.052 4＞0.05為不顯著。離散系數表示實驗的精確度，其值越小，實驗結果的可靠性越高，本實驗的離散系數為1.32%，在可接受范圍內。由回歸方程系數顯著性檢驗可知，模型（1）的一次項（P＜0.01）影響極顯著，二次項（P＜0.01）影響均極顯著。這都說明模型擬合程度良好，試驗誤差小，該模型能夠反映響應值的變化，即實驗結果可靠，可以用此模型鲊辣椒發(fā)酵的總酸含量進行分析和預測。

2.2.2 純種發(fā)酵條件對鲊辣椒氨基酸態(tài)氮含量的影響

以鲊辣椒發(fā)酵氨基酸態(tài)氮總量（Y2）為因變量，建立回歸模型?；貧w方程為：

表9 辣椒氨基酸態(tài)氮含量二次響應模型方差分析Table 9 Analysis of variance for the quadratic response model for amino nitrogen content

以模型（2）回歸模型進行方差分析。由表9可知，模型極顯著（P＜0.000 1），因變量與所考察自變量之間的線性關系顯著（R2=0.938 4），說明該模型能解釋93.84%響應值的變化，失擬項不顯著（P＞0.05）。離散系數為6.82%，在可接受范圍內。復相關系數越大，表明要變量之間的線性相關程度越密切，該模型的調整復相關系數（=0.889 2）接近1，說明變量間的線性相關程度密切。綜上所述，該試驗結果可靠，本試驗所得二次回歸方程能很好地對響應值進行預測。

由回歸方程系數顯著性檢驗可知，模型（2）的一次項X1、X2、X3、X4影響均極顯著（P＜0.01）；X5不顯著（P=0.710 9＞0.05）。對一次項回歸系數的絕對值大小進行比較，從F值可以看出對鲊辣椒氨基酸態(tài)氮含量的影響作用的大小順序為：X1＞X2＞X4＞X3＞X5，即原料配比＞接種量＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞食鹽添加量。

2.2.3 純種發(fā)酵條件對鲊辣椒感官評價的影響

以鲊辣椒發(fā)酵感官評分（Y3）為因變量，建立回歸模型?；貧w方程為：

以模型（3）進行方差分析。由表10可知，模型（3）極顯著（P＜0.000 1），因變量與所考察自變量之間的線性關系顯著（R2=0.962 0），說明該模型能解釋96.20%響應值的變化，失擬項不顯著（P＞0.05）。離散系數（1.45%）在可接受范圍內。該模型的調整復相關系數（=0.931 6）接近1，則變量間的線性相關程度密切。這都說明試驗結果可靠，本試驗所得二次回歸方程能很好地對響應值進行預測。

由回歸方程系數顯著性檢驗可知，模型（3）的一次項和二次項（P＜0.01）影響均極顯著；交互項（P＞0.05）影響均不顯著。對一次項回歸系數的絕對值大小進行比較可知，對鲊辣椒氨基酸態(tài)氮含量的影響作用的大小順序為：X3＞X4＞X2＞X1＞X5，發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時間＞原料配比＞食鹽添加量。

2.3 驗證實驗

利用Design Expert 7.0軟件處理后，優(yōu)化得到各個因素的最優(yōu)值分別為：m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）＝1.02∶1、接種量5.37%、發(fā)酵溫度31.84 ℃、發(fā)酵時間4.26 d、食鹽添加量2.93%。為檢驗實驗結果與真實情況的一致性，對上述優(yōu)化條件進行驗證實驗。同時考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為：m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）＝1∶1、接種量5.5%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時間4 d、食鹽添加量3.0%。在此條件下進行3次平行實驗，得到的實際值為：總酸含量（1.22±0.13）%、氨基酸態(tài)氮含量（0.281±0.041）%、感官評價（89.47±0.21）分。因此，該模型預測值與試驗值之間的誤差在3%以內，經響應面法優(yōu)化所得的發(fā)酵最佳工藝參數準確可靠，具有實際應用價值。

3 結 論

通過單因素試驗和中心組合設計試驗，采用響應面分析法優(yōu)化鲊辣椒的純種發(fā)酵工藝條件，得出優(yōu)化工藝條件參數為：m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）＝1∶1、接種量5.5%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時間4 d、食鹽添加量3.0%。在此條件下鲊辣椒感官評分、總酸含量和氨基酸態(tài)氮含量分別為89.47、1.22%和0.28%。在本實驗范圍內建立的二次線性回歸模型準確有效，試驗的擬合性較好。在此條件下，發(fā)酵所得鲊辣椒成品色澤鮮艷，微酸微辣，風味濃郁。

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