田 園，孫志昶，余群力,，張文華，楊 勤

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.寧夏廈華肉食品有限公司，寧夏 中衛(wèi) 755000；3.甘南州畜牧科學(xué)研究所，甘肅 合作 747000）

牦牛（yak）主要分布在我國低氣壓、高海拔、暖季短、冷季長的高寒高山草原[1]。甘南位于青藏高原和秦嶺山地的過渡地帶，平均海拔3 000 m左右，草場資源豐富，無污染，是廣受消費(fèi)者青睞的天然綠色食品[2]。但近年來牦牛肉的嫩度、多汁性等品質(zhì)指標(biāo)嚴(yán)重制約了甘南牦牛肉的內(nèi)銷和出口。牦牛肉肌纖維較粗，在冷藏過程中會發(fā)生僵直現(xiàn)象，這些因素都導(dǎo)致了牦牛肉的適口性和嫩度較差[3]。

電刺激（electrical stimulation）通常應(yīng)用在牛肉和羊肉生產(chǎn)中，可以有效防止冷藏過程中的僵直現(xiàn)象[4]。此外，電刺激還可以有效提高肉的色澤，緩解肉的熱環(huán)現(xiàn)象[5]。2003年Hwang等[6]指出電刺激可以通過加快糖酵解和降低pH值來防止冷收縮，破壞肌纖維結(jié)構(gòu)，加快肌肉組織的溶解，從而改善肉的嫩度。

1977年Dutson等[7]首次發(fā)現(xiàn)電刺激改變了牛背最長肌的超微結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)大量攣縮帶，破壞了肌節(jié)結(jié)構(gòu)；此外，在1982年Sorinmade等[8]指出電刺激處理會使超過30%的肌肉的超微結(jié)構(gòu)被破壞（60 Hz，145～250 V，2 min），這對肉的嫩化起著重要作用；2002年Hwang等[9]發(fā)現(xiàn)對牛胴體進(jìn)行頻率分別為14.3 Hz（宰后45 min，800 V，55 s）和36 Hz（45 V，宰后立即處理，45 s）的電刺激，肌節(jié)的收縮程度分別是89%和55%。

本實(shí)驗(yàn)研究不同電刺激時(shí)間處理對牦牛肉成熟過程中剪切力、肌原纖維小片化指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）及肌纖維超微結(jié)構(gòu)變化的影響，探索尋找最佳牦牛肉宰后處理工藝，以期為中國牦牛肉產(chǎn)業(yè)化、品質(zhì)的改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機(jī)選取20頭自然放養(yǎng)條件下健康的3～5歲甘南公黑牦牛，由自臨夏市清河源清真食品有限責(zé)任公司提供，體質(zhì)量為（300±50）kg，宰前禁食禁水。

氯化鉀、磷酸鉀、EDTA、氯化鎂、疊氮鈉、戊二醛、四氧化鋨、乙醇、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

C-LM4型數(shù)顯式肌肉嫩度儀 北京天翔飛 域儀器設(shè)備有限公司；FA2004B電子天平 上海佑科儀器有限公司；756P紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī) 長沙湘儀 有限公司；ES-4型電刺激儀 查韋斯機(jī)械制造（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

電刺 激處理組（electrical stimulation and chilling，ESC）：牦牛刺殺放血后，在10 min內(nèi)采用查韋斯機(jī)械制造有限公司生產(chǎn)的ES-4型電刺激儀進(jìn)行電刺激（輸出電壓為21V，額定功率為50 W），電刺激時(shí)間分別為72、90、108 s。常規(guī)冷卻排酸組（normal chilling，NC）：牦牛經(jīng)正常屠宰流程屠宰。兩組屠宰后胴體劈半，置于0～4 ℃、風(fēng)速0.5 m/s環(huán)境下成熟。在成熟過程中的第0、1、3、5、7、9天取背最長肌，測定其剪切力、MFI、肌纖維超微結(jié)構(gòu)。

1.3.2 剪切力測定

取形狀規(guī)則（5 cm×5 cm×5 cm）的肉樣，水浴至中心溫度75 ℃后取出肉塊，冷卻至室溫，順著肌纖維方向用直徑1.27 cm的取樣器鉆取3個(gè)肉柱，用壓力儀測定每個(gè)肉柱的剪切力值，取平均值。

1.3.3 MFI測定

稱取2 g新鮮背最長肌肉樣，與8 mL MFI緩沖液（100 mmol KCl、20 mmol K3PO4、1 mmol EDTA、1 mmol MgCl2、1 mmol NaN3，pH 7.1）均質(zhì)，在1 000×g離心15 min，棄去上清液，沉淀用8 mL MFI緩沖液混合均勻后于1 000×g離心15 min，棄去上清液。沉淀再與10 mL MFI緩沖液混合，用200目篩子過濾，所得濾液采用雙縮脲法測定蛋白含量，用MFI緩沖液稀釋蛋白質(zhì)量濃度到0.5 mg/mL，在540 nm波長處測定吸光度，所得結(jié)果乘以200，得MFI值[10]。

1.3.4 肌原纖維超微結(jié)構(gòu)測定

取各時(shí)間點(diǎn)的新鮮背最長肌肉樣，用刀片順著肌纖維方向切成2 mm×1 mm×1 mm的小塊，用2.5%的戊二醛固定液進(jìn)行固定24 h以上，再將樣品修剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，在1%OsO4固定液中二次固定1 h。隨后用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、80%、90%、100% 的乙醇脫水。用Epon812樹脂包埋，隨后將樣品放入60 ℃恒溫箱內(nèi)3 d。用超薄切片機(jī)制備超薄切片，再用2%醋酸雙氧鈾和6.18%檸檬酸鉛溶液進(jìn)行染色。最后在透射電鏡下觀察肌原纖維超微結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得測定數(shù)據(jù)，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Origin作圖軟件進(jìn)行圖形制作。

2 結(jié)果分析

2.1 不同電刺激時(shí)間對牦牛肉宰后成熟過程中剪切力的影響

由圖1可知，不同處理組的牦牛肉在宰后成熟過程中剪切力呈下降趨勢，ESC處理組的成熟時(shí)間明顯比NC的時(shí)間短，且在不同電刺激時(shí)間作用下，ESC90 s處理組成熟時(shí)間最短，ESC72 s處理組次之，ESC108 s處理組相對最長。在宰后0 d，采用ESC108 s處理組的牦牛的背最長肌的平均剪切力值要比其他處理組高，可能是由于長時(shí)間的電刺激導(dǎo)致牦牛肉發(fā)生熱收縮，使肉韌化[11]，而在之后的成熟過程中ESC處理組的剪切力值迅速下降，且都低于NC，在第9天，與NC組相比，電刺激組分別比NC低12.9%、17.9%和5.9%（P＜0.01）。

圖1 不同電刺激時(shí)間作用下牦牛肉剪切力的變化Fig.1 Effect of electrical stimulation time on the shear force of yak meat during postmortem aging

2.2 不同電刺激時(shí)間對牦牛肉宰后成熟過程中MFI的影響

圖2 不同電刺激時(shí)間作用下牦牛肉MFI的變化Fig.2 Effect of electrical stimulation time on the MFI of yak meat during postmortem aging

MFI值反映了肌纖維被降解及破壞的程度[12]，越大，肌纖維破壞程度越大，即肌纖維破碎程度越嚴(yán)重，相應(yīng)的剪切力值越小，嫩度越好，因此，MFI值與肉的嫩度密切相關(guān)。由圖2可知，不同處理組的牦牛肉在宰后成熟過程中MFI呈上升趨勢，ESC處理組的MFI的上升速度普遍比NC快，MFI值的增加被認(rèn)為是μ-鈣激活酶作用的結(jié)果[13]，電刺激使肌漿網(wǎng)破裂，鈣離子釋放，激活了鈣激活酶，使MFI快速升高；且在不同電刺激時(shí)間作用下，ESC90 s處理組的MFI值上升最快。在宰后0 d，ESC90s處理組的牦牛肉MFI平均值分別比其他處理組高18.87%、46.65%和18.08%；ESC108 s處理組的牦牛肉MFI值最低，這與圖1中ESC108 s處理組的牦牛肉在宰后0 d剪切力值最高相符，可能是由于長時(shí)間的電刺激導(dǎo)致牦牛肉發(fā)生熱收縮，使肉韌化[11]，隨后各處理組的MFI值隨著成熟時(shí)間的延長開始上升，ESC90 s處理組的MFI值上升最快，NC最慢。第9天ESC108 s和NC處理組的MFI值達(dá)到了103左右，且相差不大沒有顯著性差異；ESC72 s和ESC90 s處理組分別比NC組高7.71%和9.86%。

2.3 成熟過程中MFI與剪切力的線性回歸分析

表1 成熟過程中不同電刺激時(shí)間MFI和剪切力線性回歸分析Table 1 Regression analysis between MFI and shear force with different electrical stimulation times

由表1可知，不同處理組在成熟過程中剪切力和MFI呈線性相關(guān)（P＜0.01），表明了牦牛肉在宰后9 d的成熟過程中，嫩度與肌纖維的降解密切相關(guān)。

2.4 不同電刺激時(shí)間對牦牛肉肌纖維超微結(jié)構(gòu)的影響

圖3 不同電刺激時(shí)間對宰后0 d牦牛肉背最長肌肌纖維超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of electrical stimulation on myofibrillar structure of yak M.longissimus at 0 d postmortem

由圖3可知，宰后0 d，NC組肉樣的肌纖維超微結(jié)構(gòu)顯示正常，排列有序，亮帶、暗帶、Z線、M線排列整齊、清晰。然而ESC處理組中有攣縮帶（B：1；C：1）和拉伸帶（B：2；C：2、3；D：1）的形成，肌節(jié)長度明顯收縮，肌纖維的正常排列被破壞，肌節(jié)間隙變寬，且在一定范圍內(nèi)相鄰Z線重疊，出現(xiàn)不規(guī)則形變，且單個(gè)肌纖維觀察上去呈現(xiàn)兩頭單薄中間粗厚的形狀，與NC組相比，ESC處理組的肌纖維直徑分別是NC組的57.47%、68.97%和80.46%，這與Hwang等[9]的研究結(jié)果相符，其研究指出電刺激可以改變肌纖維的正常排列，出現(xiàn)攣縮帶，且改變了肌節(jié)形狀，使肌纖維直徑變小，肌節(jié)間隙變寬，使肌節(jié)的收縮可以達(dá)到55%。

由圖4可知，牦牛宰后成熟5 d，肌纖維結(jié)構(gòu)被破壞。NC組肉樣中部分Z線被蛋白酶降解，發(fā)生了斷裂，導(dǎo)致部分及纖維在亮帶處發(fā)生斷裂，有少量Z線殘骸出現(xiàn)；而ESC處理組中肌纖維結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，甚至在一定范圍內(nèi)肌纖維被溶解，臨近攣縮帶的區(qū)域Z線被溶解甚至消失，M線模糊不清；在非攣縮帶中，肌纖維大面積斷裂、溶解，出現(xiàn)了肌原纖維小片[14]，這與MFI值的升高相符。ESC處理組肉樣在電子顯微下觀察到分別有14%、21%和12%的肌纖維被溶解。

圖4 不同電刺激時(shí)間對宰后5 d牦牛肉背最長肌肌纖維超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of electrical stimulation on myofibrillar structure of yak M.longissimus at 5 d postmortem

圖5 不同電刺激時(shí)間對宰后9 d牦牛肉背最長肌肌纖維超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of electrical stimulation on myofibrillar structure of yak M.longissimus at 9 d postmortem

由圖5可知，牦牛宰后成熟的第9天，肌纖維遭到嚴(yán)重破壞。NC組中有22%的肌纖維被溶解，M線變得模糊不清，肌節(jié)間隙明顯變快；ESC處理組中肌纖維發(fā)生大面積破壞、溶解，ESC72 s處理組中有高達(dá)47%的肌纖維被溶解，出現(xiàn)了大量肌原纖維小片，Z線斷裂程度加重；ESC90 s中肌纖維結(jié)構(gòu)被完全破壞，攣縮帶內(nèi)肌纖維直徑變大，亮帶、暗帶界限消失，Z線、M線溶解消失，整個(gè)區(qū)域模糊不清，這與Dutson等[7]的研究結(jié)果一致；ESC108 s處理組在電子顯微鏡下觀察到有36%的肌纖維被溶解，平均肌纖維直徑為1.2 μm，Sorinmade等[8]研究指出，牛肉經(jīng)電刺激處理后，隨著冷卻排酸的進(jìn)行，肌纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，被逐漸降解破壞，在成熟的第7～10天，有20%～40%的肌纖維被破壞降解，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

3 討 論

電刺激作用可以明顯加速宰后牦牛肉成熟過程中剪切力的下降，即加速了牦牛肉的嫩化過程；而對比不同電刺激時(shí)間，可以發(fā)現(xiàn)ESC90 s處理組的剪切力下降速度最快，嫩化過程最短，在宰后第7天即可達(dá)到最低水平；而最終值，電刺激組比NC組分別低12.9%、17.9%和5.9%。2010年Gursansk等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)，電刺激作用對牛肉的嫩化效果明顯，且不受牛種差異的影響，甚至經(jīng)電刺激處理的硬牛肉比天然的牛肉嫩度還要好。關(guān)于電刺激嫩化肉品的機(jī)理，國內(nèi)外學(xué)者眾說紛紜，但是普遍認(rèn)為是由以下兩方面引起：一方面，電刺激加速了肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子的釋放，導(dǎo)致了肌纖維發(fā)生收縮，改變了肌纖維超微結(jié)構(gòu)[16]；另一方面，電刺激處理導(dǎo)致的宰后胴體高溫低pH值加強(qiáng)了酶活性，加速了蛋白的降解[17]。這與我們觀察到的肌纖維超微結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。

電刺激作用可以加快牦牛肉宰后MFI值的上升速度，而且ESC處理組的MFI值較NC組上升快，ESC90 s處理組中初始的MFI值分別比其他處理組高18.87%、46.65%和18.08%，且最終值ESC處理組要高于NC組。這就說明了電刺激作用加劇了牦牛肉宰后成熟過程中肌原纖維小片化的程度。2011年Bjarnadóttir等[18]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)牛肉經(jīng)電刺激處理會使其中的不溶性蛋白發(fā)生改變，具體指牛肉經(jīng)電刺激處理后，其長鏈蛋白減少，而小分子蛋白增加，這正好證明了該實(shí)驗(yàn)中MFI值上升的原因。MFI值的增加正好可以反映牦牛肉成熟的進(jìn)行。因此，電刺激處理對改善牦牛肉的嫩度有明顯作用。

通過肌纖維超微結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，電刺激作用可以改變牦牛肉肌纖維結(jié)構(gòu)排列，甚至破壞肌纖維結(jié)構(gòu)，形成了攣縮帶和拉伸帶，隨著成熟時(shí)間的延長，逐漸出現(xiàn)了肌原纖維小片，這與MFI值的上升相符。1977年Dutson等[7]首次發(fā)現(xiàn)，電刺激處理的牛的背最長肌，其攣縮帶是通過肌節(jié)的拉伸和形變形成的。Geroge等[19]隨后在1980年發(fā)現(xiàn)牛胴體經(jīng)電刺激處理后（700 V，25 pps，2 min宰后），其攣縮帶的出現(xiàn)是因?yàn)殡姶碳ふT導(dǎo)的局部肌漿網(wǎng)鈣離子的過量釋放導(dǎo)致的肌肉強(qiáng)直收縮的結(jié)果，攣縮帶對肌纖維超微結(jié)構(gòu)的破壞作用降低了剪切力，改善了嫩度。而Savell等[20]研究指出電刺激處理改變了肌節(jié)長度，主要是因?yàn)閿伩s帶的作用，在攣縮帶形成的區(qū)域，I線和Z線排列極不規(guī)則，攣縮帶相鄰的區(qū)域肌節(jié)長度發(fā)生改變，因此出現(xiàn)了肌節(jié)的拉伸和收縮。

4 結(jié) 論

電刺激作用加速了宰后牦牛肉成熟過程中剪切力的下降，第9天，ESC處理組的平均剪切力分別比NC組低12.9%、17.9%和5.9%；加快牦牛肉宰后MFI值的上升，第9天，ESC72 s和ESC90 s處理組分別比NC組高7.71%和9.86%。電刺激作用破壞了肌纖維結(jié)構(gòu)，肌節(jié)直徑明顯收縮，分別是NC組肌節(jié)直徑的57.47%、68.97%和80.46%；有高達(dá)47%的肌纖維被溶解，這與Sorinmade等[8]的研究結(jié)果一致。不同處理組在成熟過程中剪切力和MFI呈線性相關(guān)（P＜0.01）。因此，電刺激可以顯著改善毛牛肉嫩度，促進(jìn)牦牛肉的成熟，具有廣闊的市場前景。在本研究基礎(chǔ)上，后期研究可通過對其細(xì)胞形態(tài)、線粒體形態(tài)以及蛋白降解進(jìn)行研究，進(jìn)一步闡明電刺激嫩化牦牛肉的機(jī)理。

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