梁姍姍，劉俊榮，馬永生，吳 忠，閆瑞霞，李 芳

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023）

貝類在中國漁業(yè)經(jīng)濟(jì)活動(dòng)中占有非常重要的地位，2007年底我國啟動(dòng)了一項(xiàng)“農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)”的科技支撐項(xiàng)目，貝類被納入其中[1]。2010年，全國海水貝類總產(chǎn)量達(dá)1 224.2萬 t，占水產(chǎn)品總產(chǎn)量的22.8%[2]，其中蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）是我國北方的主要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一。扇貝外套膜占扇貝總質(zhì)量的8%左右[3]，是扇貝加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。扇貝外套膜中含有大量的泥沙，極難去除，因?yàn)閭€(gè)體較小，加工比較困難，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此直接加工制成的食用產(chǎn)品價(jià)格偏高，外觀和口感都較差，一直不被消費(fèi)者所接受。只有少部分作為動(dòng)物飼料低價(jià)出售，造成資源的浪費(fèi)。

扇貝外套膜中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)的含量很高，是一種很有價(jià)值的蛋白質(zhì)源[4]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)扇貝外套膜生理活性物質(zhì)的提取研究較多，研究發(fā)現(xiàn)扇貝外套膜的提取物具有降血脂、抗病毒、抗衰老等多種生理功能[5-6]，但從食用角度出發(fā)，對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行分離提取的研究較少。本研究以扇貝外套膜為原料，通過等電點(diǎn)絮凝法提取外套膜分離蛋白，以便進(jìn)一步開發(fā)功能性食品蛋白質(zhì)配料，進(jìn)而為扇貝外套膜高附加值的開發(fā)應(yīng)用探索新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活的蝦夷扇貝購自大連長興水產(chǎn)品市場(chǎng)，將新鮮原料去殼，取出扇貝柱，然后將扇貝全邊中的消化腺、生殖腺除去，用清水沖洗干凈，瀝干即得蝦夷扇貝外套膜。封裝標(biāo)記后置于冰箱中-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

氫氧化鈉 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；硫酸銅 沈陽聯(lián)邦試劑廠；硫酸鉀 天津博迪化工股份有限公司；乙醚天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；十二烷基磺酸鈉、考馬斯亮藍(lán)R-250、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；721型分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；MV-Ⅲ垂直平板電泳槽 大連競邁生物科技有限公司；CR-410色彩色差儀 柯尼卡美能達(dá)投資有限公司；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)的溶解與回收

冷凍蝦夷扇貝外套膜置于室溫下解凍，在半解凍狀態(tài)下切碎后稱取200 g，按1∶9（m/V）的比例加入去離子水，攪拌均勻后倒入勻漿機(jī)中勻漿2 min。漿液溫度保持在10 ℃以下。勻漿液分裝22份，每份50 mL，以0.5個(gè)pH值為梯度，一部分用2 mol/L HCl依次調(diào)節(jié)pH 1.5（酸處理），另一部分用2 mol/L NaOH依次調(diào)節(jié)pH值到12.0（堿處理）。用高速冷凍離心機(jī)4 ℃、9 000 r/min離心20 min，取中層清液，用2 mol/L HCl或2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)蝦夷扇貝外套膜溶出物至等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃、9 000 r/min離心20 min，得到分離蛋白和未回收溶出物。

1.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定

水分測(cè)定采用GB/T5009.3—2003《食品中水分的測(cè)定》直接干燥法；粗脂肪測(cè)定采用GB/T5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》索氏抽提法；粗蛋白的測(cè)定采用GB/T5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》微量凱氏定氮法；灰分的測(cè)定采用GB/T5009.4—2003《食品中灰分的測(cè)定》灼燒稱質(zhì)量法。

1.3.3 蛋白質(zhì)溶解度和回收率的測(cè)定

采用雙縮脲法測(cè)定總蛋白及上層清液中蛋白質(zhì)的含量[7]，用721型分光光度計(jì)在波長540 nm測(cè)定其吸光度。蛋白質(zhì)溶解度與回收率的計(jì)算公式參見傅潤澤等[8]的方法。

以0.5個(gè)pH值為梯度測(cè)定扇貝蛋白在pH值1.5～12.0范圍的蛋白質(zhì)溶解度和回收率，計(jì)算公式如式（1）、（2）所示。

式中：m1為第1次離心中層清液蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；m2為第2次離心上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；m3為總蛋白質(zhì)質(zhì)量/g。

1.3.4 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分析

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）對(duì)酸堿提取過程中各部分的蛋白質(zhì)組成進(jìn)行分析。選取pH 1.5、12.0兩個(gè)pH值點(diǎn)。分析的樣品包括勻漿液、分離蛋白、未溶解沉淀物及未回收溶出物。樣品與4×SDS樣品緩沖液以3∶1的體積比混合，加入5%的β-巰基乙醇，在95 ℃條件下水浴10 min，在5%濃縮膠、12%分離膠下進(jìn)行電泳。電泳膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色液脫色。

1.3.5 蛋白質(zhì)功能特性

蛋白質(zhì)的持水性測(cè)定方法為[9]，稱取0.5 g樣品（m）置于已知質(zhì)量的離心管（m1）中，加入20 mL蒸餾水。在室溫下攪拌，使蛋白質(zhì)溶液成漿狀；靜置30 min后，在3 000 r/min離心20 min；棄去上清液，再次稱量離心管（m2），按照公式（3）計(jì)算持水性。

蛋白質(zhì)持油性的測(cè)定方法為[10]：稱取0.5 g樣品（m）置于已知質(zhì)量（m1）的離心管中，加入10 mL大豆油，攪拌混合物使其均勻，靜置30 min后，在3 000 r/min下離心20 min，棄去上清液，再次稱離心管質(zhì)量（m2），按照公式（4）計(jì)算持油性。

蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定方法為[11]：將測(cè)試蛋白配制成5 g/100 mL的水懸液，取30 mL放入100 mL離心管中，用高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2 min，立即記錄此時(shí)溶液上部泡沫體積，靜置30 min后，再次記錄其泡沫體積。按照公式（5）、（6）計(jì)算起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定采用濁度法[12]。配制1 g/100 mL的蛋白液，取5 mL大豆油與15 mL待測(cè)溶液于均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)2 min，分別于0、10 min時(shí)從底部取50 μL，用0.1%SDS稀釋100 倍后測(cè)OD500nm。按照公式（7）、（8）計(jì)算乳化性和乳化穩(wěn)定性。

式中：n為稀釋倍數(shù)；A為500 nm波長處的吸光度；φ為油相所占的分?jǐn)?shù)，本實(shí)驗(yàn)中油相占1/4；ρ為0.01，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度/（g/mL）。

式中：A0為0 min時(shí)的乳化液500 nm波長處的吸光度；t為靜置時(shí)間（10 min）；A10為乳化液靜置10 min后的吸光度。

1.3.6 色度分析

使用CR-410色彩色差儀來確定分離蛋白及原料的顏色特性，每個(gè)樣品測(cè)量3次，得到L*、a*和b*值，其中L*值表示產(chǎn)品的亮度即從黑（0）到白（100）的顏色，a*值表示紅度（＋）或綠度（-）值，正值越大偏向紅色的程度越大，負(fù)值越大偏向綠色的程度越大；b*值表示黃度（＋）或藍(lán)度（-）值，正值越大偏向黃色的程度越大，負(fù)值越大偏向藍(lán)色的程度越大；白度則根據(jù)式（9）計(jì)算[13]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦夷扇貝外套膜蛋白溶解度的變化規(guī)律

蛋白質(zhì)的溶出不僅是等電點(diǎn)絮凝回收的前提，而且，在溶出過程中還可以使色素、脂肪、灰分以及結(jié)締組織等成分與蛋白質(zhì)分離[14-15]。在pH 1.5～12.0范圍內(nèi)，蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)的溶解規(guī)律如圖1所示。

圖1 扇貝外套膜蛋白質(zhì)在不同pH值的溶解度變化曲線Fig.1 Solubility of Patinopecten yessoensis mantle proteins as a function of pH

由圖1可知，在酸性及堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)最大溶解度均出現(xiàn)在極端pH值條件下，分別為pH 1.5和pH 12.0，在酸性的pH 4.0以下和堿性的pH 9.0以上時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度均急劇增加，這要?dú)w因于肌肉蛋白質(zhì)分子所帶的凈正電荷或凈負(fù)電荷增加。帶同種電荷的蛋白質(zhì)分子之間相互排斥，從而保證蛋白質(zhì)分子處于分離狀態(tài)；同 時(shí)帶電的蛋白質(zhì)分子與水分子之間形成離子-偶極作用而被溶劑化[16]。在pH 4.0～9.0內(nèi)，蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷不足，與水分子間的作用較弱，蛋白質(zhì)分子之間趨于相互作用，所表現(xiàn)出的溶解度也不高，這與Undeland[17]、Gehring[18]等的研究結(jié)果相似。在pH 4.5～5.0時(shí)溶解度最低，此為扇貝外套膜蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。與之相比，通常魚肉蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為pH 5.5，這可能是由于扇貝外套膜與魚肉蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)的組成與結(jié)構(gòu)方面存在一定的差異性。

2.2 蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)回收率的變化規(guī)律

圖2 蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)在不同pH值的回收率變化曲線Fig.2 Recovery rate of Patinopect en yessoensis mantle proteins as a function of pH

圖3 蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)溶解度與回收率的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between Patinopecten yessoensis mantle protein solubility and recovery rate

由圖2可知，回收率變化規(guī)律與溶解度變化規(guī)律基本一致。由圖3可知，二者具有十分顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7。無論是酸處理還是堿處理，蛋白質(zhì)的最大回收率均發(fā)生在其溶解度最高的pH值點(diǎn)，分別為83.31%及90.75%。與魚類分離蛋白回收率（60%～80%）相比[8]，蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)回收率相對(duì)較高。

2.3 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白分子質(zhì)量分析

利用SDS-PAGE法對(duì)蝦夷扇貝外套膜分離蛋白及其制備過程中未回收部分 中各組分蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4、5。

圖4 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE of the protein isolates extracted from Patinopecten yessoensis mantle

圖5 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白制備過程中未回收部分的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.5 SDS-PAGE of unrecovered protein fractions during Patinopecten yes soensis mantle protein isolation

由圖4可知，蝦夷扇貝外套膜主要蛋白質(zhì)組分有肌球蛋白、副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白以及原肌球蛋白等，而酸分離蛋白和 堿分離蛋白的條帶與原料很相似。扇貝是無脊椎動(dòng)物，其蛋白質(zhì)的組成及結(jié)構(gòu)與脊椎動(dòng)物存在一定的 差異性，分布在100 kD附近的蛋白質(zhì)條帶是副肌球蛋白，它是無脊椎動(dòng)物特有的肌原纖維蛋白質(zhì)[19]。由圖5可知，酸溶和堿溶過程有少量蛋白質(zhì)未被溶出，堿處理未溶出沉淀中的蛋白條帶較酸處理的多，泳道3和4中酸處理和堿處理未回收溶出物的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量都在40 kD左右。對(duì)比圖4、5可知，等電點(diǎn)絮凝法能夠有效回收大部分的蛋白質(zhì)溶出物組分，使得未回收溶出物的蛋白含量很低，造成條帶的不清晰或無條帶。

2.4 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白基本成分分析

表1 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的基本成分（ ±s，n=3）Table 1 Proximate composition ofPatinopecten yessoensis mantle protein isolateess ( ±s, n=3)

表1 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的基本成分（ ±s，n=3）Table 1 Proximate composition ofPatinopecten yessoensis mantle protein isolateess ( ±s, n=3)

注：同列字母不同，表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

產(chǎn)物 蛋白質(zhì)含量/% 脂肪含量/% 灰分含量/%扇貝外套膜 77.78±0.79a 3.55±0.24a 3.17±0.06a酸分離蛋白 80.21±0.33b 1.02±0.06b 2.67±0.05b堿分離蛋白 84.28±0.95c 0.80±0.02b 1.81±0.18c

由表1可知，與原料扇貝外套膜相比，酸、堿分離蛋白均有較高的蛋白質(zhì)純度，分別為酸分離蛋白的80.21%及堿分離蛋白的84.28%。酸法回收蛋白與堿法回收蛋白脂肪含量得到明顯降低，從原料的3.55%分別下降到1.02%及0.80%，脂肪含量較低，更利于貯存，這說明分離處理能夠有效去除原料中的脂肪。

2.5 蝦夷扇貝外套膜及其分離蛋白的色度分析

產(chǎn)品的色澤外觀是影響產(chǎn)品感官特性的第一因素，表2比較了酸法分離蛋白、堿法分離蛋白與原料扇貝外套膜的顏色差別。與原料相比，酸分離蛋白和堿分離蛋白均表現(xiàn)出較高的白度，其中酸分離蛋白的白度更高，對(duì)于魚類肌肉，通常其堿分離蛋白的白度要高于酸分離蛋白[20]，這可能是由于堿法能夠去除更多的血紅蛋白。堿法處理后，在等電點(diǎn)范圍內(nèi)有大量的血紅蛋白處于溶解狀態(tài)，未被沉淀出來，從而與其他蛋白分離，而酸法處理則恰恰相反[13]，但也有相反的研究報(bào)道[21]。酸分離蛋白和堿分離蛋白的亮度L*均有顯著提升，a*和b*都為正值，且都有下降，a*值反映的是紅值，b*值反映的是黃值，紅值和黃值均減小說明兩種方法都能有效地去除部分的天然色素類物質(zhì)，兩種蛋白的白度均大于原料，說明兩種蛋白的感官接受度較原料均有提高。

表2 蝦夷扇貝外套膜及其分離蛋白的色度值（ ±s，n=3）Table 2 Color values of Patinopecten yessoensis mantle and proteiinn isolates (±s, n =3)

表2 蝦夷扇貝外套膜及其分離蛋白的色度值（ ±s，n=3）Table 2 Color values of Patinopecten yessoensis mantle and proteiinn isolates (±s, n =3)

指標(biāo) 扇貝外套膜 酸分離蛋白 堿分離蛋白L* 60.65±0.09a 68.55±0.16c 67.20±0.31b a* 4.97±0.20a 3.48±0.07c 2.78±0.06b b* 12.55±0.14a 11.02±0.28b 12.17±0.22a白度 58.40±0.04a 66.49±0.22b 6 4.91±0.26c

2.6 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白功能特性

表3 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的功能性質(zhì)Table 3 Functional properties of Patinopecten yessoensis mantle protein isolates

由表3可知，與大豆蛋白相比，酸法與堿法分離蛋白除了持油性稍高，其他包括持水性、發(fā)泡性和乳化性都較差，因此需要進(jìn)一步研究來提高蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的功能性，從而增強(qiáng)其在食品中的應(yīng)用性。

3 結(jié) 論

等電點(diǎn)絮凝法能有效地對(duì)蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)進(jìn)行分離回收。研究發(fā)現(xiàn)蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH 4.5～5.0范圍內(nèi)；分離產(chǎn)物不僅蛋白質(zhì)純度高，且有明顯的脫脂及脫色效果?？傊?，等電點(diǎn)絮凝法對(duì)于開發(fā)利用蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)極具潛力。今后，就分離蛋白的功能性開發(fā)方面，有待進(jìn)一步研究。

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