王斯晟，桂斌捷，周 健，王 剛

MMP-13在早期股骨頭壞死滑膜中的表達

王斯晟1，桂斌捷1，周 健2，王 剛2

目的分析早期股骨頭壞死（ONFH）患者滑膜中基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）的表達，探討其在ONFH病情進展中的作用。方法選取30例早期ONFH患者（壞死組）、30例髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（OA）患者（OA組）、30例股骨頸骨折患者（骨折組），術(shù)中取滑膜組織，采用免疫組織化學技術(shù)檢測滑膜中MMP-13蛋白的表達及滑膜形態(tài)學改變，并采用RT-PCR技術(shù)檢測滑膜中MMP-13 mRNA的表達水平。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，MMP-13蛋白于壞死組及OA組中表達與骨折組中表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而壞死組與OA組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；RT-PCR結(jié)果顯示壞死組與OA組的MMP-13 mRNA表達量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論MMP-13蛋白與mRNA在壞死組與OA組中呈高表達，表明兩者可能有著相同的滑膜病變機制，但壞死組mRNA表達較OA組更高，表明滑膜病變的程度可能存在差異。

股骨頭壞死；滑膜；金屬基質(zhì)蛋白酶-13；免疫組化；RT-PCR

目前股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoralhead，ONFH）的研究多集中于股骨頭骨質(zhì)及軟骨結(jié)構(gòu)的改變，而臨床工作中發(fā)現(xiàn)ONFH患者在股骨頭塌陷之前已經(jīng)出現(xiàn)了滑膜反應(yīng)，如關(guān)節(jié)滑液增多、滑膜增生、滑膜侵蝕軟骨等炎性改變［1］。因此，滑膜在ONFH，特別是壞死早期的作用仍需進一步研究。金屬基質(zhì)蛋白酶-13（matrix metalloproteinases-13，MMP-13）在骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者的滑膜中廣泛表達，啟動早期的軟骨破壞機制［2］。該實驗通過驗檢測滑膜中MMP-13蛋白和mRNA的表達及滑膜形態(tài)學改變，以進一步了解ONFH早期的滑膜病理改變，并為ONFH早期針對滑膜病變的相關(guān)治療提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 滑膜樣本收集自安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科于2011年9月～2013年6月間就診并手術(shù)的患者。壞死組：30例ONFH患者，男14例，女16例，年齡22～38（28±7）歲，ONFH患者診斷均遵循2012版成人ONFH診療標準專家共識所提出的診斷標準［3］，均依據(jù)X線片及MRI確定ONFH處于FicatⅠ或Ⅱ期。并于患者行游離腓骨移植術(shù)時切取滑膜。OA組：30例髖關(guān)節(jié)OA患者，男15例，女15例，年齡60～78（69±8）歲，髖關(guān)節(jié)OA患者均遵循2012版成人ONFH診療標準專家共識所提出的診斷標準予以排除由ONFH所致的髖骨性關(guān)節(jié)炎，依據(jù)影像學Kellgren-Lawrence分級法顯示2～3級改變?；颊邿o內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)、代謝性、腫瘤或其他炎癥性疾病，無激素服用史，術(shù)前無長期服用非甾體抗炎類藥物史。于行人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)時切取滑膜。骨折組：30例股骨頸骨折病患者，男15例，女15例，年齡62～70（65±4）歲，股骨頸骨折患者均排除髖骨性關(guān)節(jié)炎病史?；颊邿o內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)、代謝性、腫瘤或其他炎癥性疾病，無激素服用史。于患者行人工股骨頭置換術(shù)時切取滑膜。所有標本均收集2份，1份予10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋后保存；1份迅速至于RNALOCKER液中，4℃過夜后，棄保護液，液氮保存。

1.2 儀器與試劑兔抗人MMP-13抗體試劑購自美國Bioworld Technology公司；PV-6000兩步法免疫組化檢測試劑購自美國GBI公司；Oligo DT、Radom primer、dNTP、5×反轉(zhuǎn)錄buffer、RNase Inhibitor、反轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Green Kit、RNAiso、DNA Marker DL1000試劑購自日本TaKaRa公司；DEPC購自美國Sigma公司；分光光度計、冷凍離心機購自美國Thermo公司；9600型PCR儀、9700型Real-Time PCR儀購自美國ABI公司；凝膠成像系統(tǒng)購自英國Alpha Innotch公司；凝膠電泳儀設(shè)備購自北京六一儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化 取各組標本蠟塊予4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，予HE染色及免疫組化PV兩步法染色，以O(shè)A組染色組織切片為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。判斷標準以細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色陽性顆粒為陽性表達。每張玻片隨機計數(shù)10個高倍鏡視野（×400），計算陽性細胞占視野內(nèi)細胞總數(shù)的百分比。根據(jù)細胞數(shù)量對陽性程度進行分級：陽性細胞數(shù)量0%～10%為陰性（－），陽性細胞數(shù)量11%～25%為弱陽性（＋），陽性細胞數(shù)量26%～50%為陽性（?），陽性細胞數(shù)量51%～100%為強陽性（?）。

1.3.2 MMP-13 mRNA提取與檢測 采用TRIzol法提取滑膜成纖維細胞總RNA。取2 μl RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：42℃15 min，95℃2 min。取2 μl cDNA進行PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)引物由上海生工公司合成：目的基因MMP-13上游為：5′-TGCTGCATTCTCCTTCAGGA-3′，下游為：5′-ATGCATCCAGGGGTCCTGGC-3′，產(chǎn)物片段183 bp；內(nèi)參基因β-actin上游為：5′-TGGACATCCGCAAAGACCTGTAC-3′，下游為：5′-TCAGGAGGAGCAATGATCTTGA-3′，產(chǎn)物片段142 bp。PCR體系反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5 min，變性94℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，共40個循環(huán)，終延伸72℃7 min。取2 μl PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。電泳條帶清晰，且與理論值相同后，取上下游引物各1 μl，cDNA 2 μl，DEPC水6 μl，SYBR Green 10 μl于Real-Time PCR儀中，經(jīng)預(yù)變性94℃5 min，變性94℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，共36個循環(huán)，測得Ct值。RT-PCR結(jié)果以2－ΔΔCt值計算相對表達量。Ct值為樣本達到一定拷貝數(shù)時所需的循環(huán)次數(shù)，以樣本目的基因的Ct值減去樣本內(nèi)參Ct值為ΔCt，以目的基因ΔCt減去對照基因ΔCt為－ΔΔCt，以此計算相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。等級資料組間差異采用秩和檢驗。計量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果標本中MMP-13蛋白陽性信號表達呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要位于胞質(zhì)，少數(shù)可見胞核著色。骨折組的滑膜組織中，MMP-13僅見于少許滑膜細胞中表達。在OA組中可見MMP-13主要表達于滑膜襯里層細胞、間質(zhì)炎性細胞及血管內(nèi)皮細胞，其陽性程度及細胞數(shù)量顯著增加。而壞死組中表達與OA組類似，MMP-13的陽性程度及細胞數(shù)量呈高表達，見表1、圖1。統(tǒng)計學分析顯示，經(jīng)Kruskal-Wallis檢驗，組間差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝17.758，P＜0.05）。經(jīng)過秩次轉(zhuǎn)換后，組間方差分析顯示，骨折組與OA組間、骨折組與壞死組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），OA組與壞死組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 MMP-13蛋白表達強度（n＝30）

圖1 免疫組化檢測MMP-13在各組織中的表達 IHC×400

2.2 RT-PCR結(jié)果擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖2。經(jīng)免疫組化分析顯示骨折組滑膜形態(tài)接近正?；そM織，MMP-13僅見少量表達與滑膜細胞中。因此以骨折組為陰性對照組，計算壞死組與OA組的MMP-13相對表達量，并比較。壞死組2－ΔΔCt值為6.941±0.843，OA組壞死組2－ΔΔCt值為6.074± 0.893。獨立樣本t檢驗分析顯示，兩組間MMP-13相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 MMP-13 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類廣泛存在于各結(jié)締組織中，在細胞外基質(zhì)的生理性和病理性降解過程中起重要作用的蛋白酶超家族。MMPs在正常細胞中的表達很低，但在OA中，MMPs則主要由軟骨細胞、滑膜成纖維細胞所表達，造成結(jié)締組織的破壞，從而啟動OA的最早期改變［4］。其中MMP-13特異性降解Ⅱ型膠原，而關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中最具特征，含量最多的是Ⅱ型膠原。MMP-13通過破壞膠原肽鏈GLY794-Leu795之間的肽鏈進而降解Ⅱ型膠原纖維，繼而破壞軟骨間的拱形結(jié)構(gòu)，最終造成關(guān)節(jié)軟骨破壞。同時其他許多MMP亞型對Ⅱ型膠原的降解需要通過MMP-13起作用。因此，MMP-13成為目前骨關(guān)節(jié)疾病研究中的重點研究的靶向分子［2，5］。

本實驗通過免疫組化及RT-PCR技術(shù)，同時檢測ONFH早期患者髖關(guān)節(jié)滑膜中MMP-13蛋白以及mRNA的表達，并與未發(fā)生OA患者（骨折組）以及已發(fā)生OA患者（OA組）的髖關(guān)節(jié)滑膜中MMP-13蛋白以及mRNA的表達進行對比。因臨床手術(shù)指征對年齡的限制，無法排除組別間年齡的統(tǒng)計學差異。但有研究［6－7］表明，成年患者中MMP-13的表達與滑膜炎癥程度相關(guān)，而與年齡及性別無顯著相關(guān)性，或僅作為混雜因素存在。而3組患者經(jīng)術(shù)前檢查均已排除合并其他炎性疾病影響，近期均無激素或非甾體類藥物服用史。因此，實驗結(jié)果僅與疾病引起的滑膜病變程度相關(guān)。免疫組化結(jié)果顯示ONFH早期滑膜已出現(xiàn)了與OA類似的滑膜改變，MMP-13的陽性表達明顯高于骨折組，與OA組間無顯著差異。這表明ONFH早期的滑膜可能已經(jīng)出現(xiàn)了與OA滑膜類似的病理改變，并且滑膜的病理改變已經(jīng)對軟骨造成了破壞?；さ难仔愿淖冊贠A中起著重要作用，但單一的急性滑膜炎癥并不能誘發(fā)OA的發(fā)生，只有在出現(xiàn)關(guān)節(jié)不穩(wěn)的因素時，才能導致OA的發(fā)生。而一旦OA形成后，引起了繼發(fā)性的滑膜炎，滑膜炎便會成為OA繼續(xù)發(fā)展的主要因素［8］。正常的滑膜組織中MMPs與組織蛋白酶抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP）的生成呈動態(tài)平衡。當滑膜炎癥時，MMPs與TIMPs間的動態(tài)平衡被打破。滑膜細胞大量表達MMPs，因此MMP-13表達增高［9］。ONFH患者早期即出現(xiàn)MMP-13表達增高，表明ONFH在早期即出現(xiàn)了類似于OA的滑膜炎性病變。

本實驗RT-PCR結(jié)果顯示ONFH早期患者滑膜中MMP-13的mRNA表達較OA組更高。這表明，雖然ONFH與OA有著相似的滑膜病理改變，但滑膜病變的程度可能仍有不同，ONFH在早期可能出現(xiàn)了更加嚴重的滑膜反應(yīng)。這可能與ONFH的病程進展有關(guān)，ONFH的發(fā)病過程經(jīng)歷了早期X線片正常的局部骨壞死、MRI提示的關(guān)節(jié)軟骨下骨壞死形成、關(guān)節(jié)軟骨下骨質(zhì)塌陷形成“新月征”、關(guān)節(jié)間隙尚正常的股骨頭塌陷變形，直到最終股骨頭塌陷扁平形成OA［10］。MMP-13的表達可能隨著ONFH病情的進展而有所不同。

本次實驗中所選取的OA患者均已排除由ONFH所引起的OA，因此實驗結(jié)果尚不能進一步說明MMP-13的表達與ONFH病程進展間的關(guān)系。MMP-13表達與ONFH病程間的相關(guān)性還有待進一步研究。

［1］ Rabquer B J，Tan G J，Shaheen P J，et al.Synovial inflammation in patients with osteonecrosis of the femoralhead［J］.Clin Transl Sci，2009，2（4）：273－8.

［2］ Takaishi H，Kimm T，Dalai S，et al.Joint diseases and matrix metalloproteinases：a role for rMMP-13［J］.Curt Pham Biotechnol，2008，9（1）：47－54.

［3］ 中華醫(yī)學會骨科分會顯微修復學組及中國修復重建外科專業(yè)委員會骨缺損及骨壞死學組.成人ONFH診療標準專家共識［J］.中華關(guān)節(jié)外科雜志，2012，6（3）：89－92.

［4］ Berenbaum F.Osteoarthritis as an inflammatory disease（osteoarthritis is not osteoarthrosis?。跩］.Osteoarthritis Cartilage，2013，21（1）：16－21.

［5］ Goldring M B，Otero M，Plumb D A，et al.Roles of inflammatory and anabolic cytokines in cartilage metabolism：signals and multiple effectors converge upon MMP-13 regulation in osteoarthritis［J］.European Cells Material，2011，21：202－20.

［6］ Koskinen A，Vuolteenaho K，Nieminen R，et al.Leptin enhances MMP-1，MMP-3 and MMP-13 production inhuman osteoarthritic cartilage and correlates with MMP-1 and MMP-3 in synovial fluid from OA patients［J］.Clin Exp Rheumatol，2011，29（1）：57－64.

［7］ 瑪麗艷，宋旭東，張德新，等.MMP-13和Galectin-3在OA滑膜組織中的臨床意義［J］.中國骨與關(guān)節(jié)雜志，2013，2（5）：280－4.

［8］ Sokolove J，Lepus C M.Role of inflammation in the pathogenesis of osteoarthritis：latest findings and interpretations［J］.Ther Adv Musculoskelet Dis，2013，5（2）：77－94.

［9］ Amǎlinei C，Cǎruntu I D，Gius′cǎ S E，et al.Matrix metalloproteinases involvement in pathologic conditions［J］.Rom J Morphol Embryol，2010，51（2）：215－28.

［10］康鵬德，裴福興.ONFH的臨床分期［J］.中華骨科雜志，2010，30（1）：25－8.

Expression of matrix metalloproteinase-13 in synovium of early osteonecrosis of femoralhead

Wang Sisheng1，Gui Binjie1，Zhou Jian2，et al
（1Dept of Joint Surgery，2Dept of Orthopaedics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo analyze the expression of matrix metalloproteinase-13 in synovium of early osteonecrosis of femoralhead（ONFH）patients，and to study its effect on progress of ONFH.MethodsSelected 30 ONFH patients（osteonecrosis group），30 Hip osteoarthritis（OA）patients（OA group），30 transcervical fracture patients（fracture group）.Synovium dissected in operations.Investigate expressing of MMP-13 protein and morphological change of synovium by immunohistochemical technology.Investigate expressing of MMP-13 mRNA of synovium by RT-PCR technology.ResultsImmunohistochemistry results showed statistically significant difference in expression of MMP-13 protein in osteonecrosis group and OA group between fracture group（P＜0.05）.No statiscially significant difference between osteonecrosis group and OA group（P＞0.05）.RT-PCR results showed statistical significantly difference in expression of MMP-13 mRNA in osteonecrosis group between OA group（P＜0.05）.ConclusionHigh expression of MMP-13 protein in osteonecrosis group and OA group show they mayhave the same synovial pathological mechanism.Higher expression of MMP-13 mRNA in osteonecrosis group than OA group show the severity of abnormality synovium is different.

osteonecrosis of the femoralhead；synovium；matrix metalloproteinases-13；immunohistochemistry；real time-polymerase chain reaction

R 681.8

A

1000－1492（2014）04－0502－04

2013－12－20接收

安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院1骨關(guān)節(jié)外科，2骨科一病區(qū)，合肥 230022

王斯晟，男，碩士研究生；桂斌捷，男，副主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：guibinjie＠163.com