吳小琴綜述 李 俊審校

◇綜 述◇

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的表觀遺傳學(xué)調(diào)控

吳小琴1，2綜述 李 俊1，2審校

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）是控制端粒酶活性的限制性成分。hTERT的表達(dá)受多種因素的調(diào)控，其中表觀遺傳學(xué)可通過DNA甲基化，組蛋白修飾及非編碼RNA調(diào)控hTERT基因的表達(dá)。有關(guān)hTERT基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)研究近幾年取得了較大進(jìn)展。hTERT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的狀態(tài)、位點(diǎn)、作用及其臨床意義，非編碼RNA對(duì)hTERT基因的表達(dá)調(diào)控等已成為研究的熱點(diǎn)。本文就表觀遺傳學(xué)對(duì)hTERT基因表達(dá)的調(diào)控作一綜述。

端粒酶；人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；表觀遺傳學(xué)；DNA甲基化；組蛋白修飾；非編碼RNA

端粒是真核細(xì)胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，可維持染色體的完整性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等［1］。在正常細(xì)胞分裂過程中由于末端復(fù)制問題，端粒逐漸縮短，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老、死亡，而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞則能通過端粒酶添加端粒重復(fù)序列TTAGGG至DNA末端，阻止端粒隨著細(xì)胞分裂而縮短，從而使細(xì)胞具有無限增殖的能力［2］。因此，端粒酶的活化是惡性腫瘤的普遍現(xiàn)象，在惡性腫瘤中其活性檢出率為85%～95%［3］。人的端粒酶主要由端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）和端粒相關(guān)蛋白（human telomerase-associated protein 1，hTP1）構(gòu)成。端粒酶依靠自身RNA模板，在hTERT催化下與hTP1作用合成端粒DNA。其中，hTERT的表達(dá)程度與端粒酶的活性密切相關(guān)，hTERT在單個(gè)體細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平為1～5拷貝，而在腫瘤細(xì)胞中基因拷貝數(shù)增加［4］。因此對(duì)hTERT表達(dá)的調(diào)控成為端粒酶研究的熱點(diǎn)。關(guān)于hTERT的調(diào)控有很多因素，比如各種小分子抑制劑、轉(zhuǎn)錄因子、hTERT磷酸化及顯性負(fù)性突變體等。

表觀遺傳學(xué)是指在不改變DNA序列的前提下使基因表達(dá)發(fā)生可遺傳性的變化，最終導(dǎo)致帶有相同DNA序列的各種細(xì)胞及組織具有不同的基因表達(dá)模式和生物學(xué)功能。表觀遺傳學(xué)調(diào)控主要有DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA等，它們?cè)谌祟惛鞣N疾病，尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。有研究［5］表明，表觀遺傳調(diào)控hTERT的活性。本文就關(guān)于hTERT基因表觀遺傳學(xué)調(diào)控的研究進(jìn)展作一綜述。

1 DNA甲基化

1.1 hTERT基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)人類hTERT基因位于第5號(hào)染色體短臂5p15.33區(qū)，由16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子組成，總長約35 kbp。hTERT基因啟動(dòng)子序列位于5’端一個(gè)5.8 kbp的基因片段中，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游181 bp區(qū)為核心啟動(dòng)子，其序列上存在多個(gè)hTERT轉(zhuǎn)錄因子（Sp1、c-myc、Est、Mad-1等）的結(jié)合位點(diǎn)。hTERT基因的轉(zhuǎn)錄受控于其啟動(dòng)子的調(diào)控。在hTERT基因啟動(dòng)子區(qū)有一個(gè)富含GC區(qū)，構(gòu)成一個(gè)CpG島，分別定位于－208～－150 bp、－310～－20 bp、－330 bp至第2個(gè)外顯子之間、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游181 bp或283 bp區(qū)域，長度59～290 bp不等，該島被認(rèn)為是DNA甲基化的一個(gè)靶點(diǎn)。

1.2 hTERT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及作用Nomoto et al［6］應(yīng)用PCR和單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)，對(duì)13株胃腸腫瘤細(xì)胞系、24例腸癌標(biāo)本及8例正常志愿者外周血細(xì)胞經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后分析，發(fā)現(xiàn)11種細(xì)胞系hTERT啟動(dòng)子序列呈高甲基化的狀態(tài)；在腫瘤標(biāo)本中6例hTERT啟動(dòng)子完全甲基化，17例呈部分甲基化，而正常組織多為非甲基化狀態(tài)。Cong et al［7］發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中hTERT啟動(dòng)子核心區(qū)（－500 bp）呈現(xiàn)高度甲基化狀態(tài)。以上研究表明hTERT啟動(dòng)子處于高甲基化狀態(tài)，然而hTERT啟動(dòng)子的這種甲基化狀態(tài)與其基因表達(dá)二者之間的關(guān)系尚不明確。多數(shù)研究表明DNA甲基化可以沉默基因表達(dá)，Liu et al［8－9］和Lopatina et al［10］證實(shí)hTERT啟動(dòng)子甲基化可沉默hTERT基因表達(dá)。另外也有研究［11－12］表明二者之間并無顯著關(guān)系。然而越來越多研究表明在腫瘤細(xì)胞中hTERT調(diào)控區(qū)的甲基化狀態(tài)促進(jìn)hTERT基因的表達(dá)。Guilleret et al［13］研究發(fā)現(xiàn)hTERT啟動(dòng)子甲基化與hTERT表達(dá)呈正相關(guān)，并且端粒酶陽性細(xì)胞系用去甲基化試劑5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）處理后hTERT表達(dá)下降，端粒酶活性降低及端?？s短。這種情況下CpG甲基化可能是通過干擾轉(zhuǎn)錄抑制因子的結(jié)合，從而正調(diào)控hTERT啟動(dòng)子。造成以上這些不同的研究結(jié)果可能的原因是臨床標(biāo)本中有正常組織的存在或由不同的研究方法導(dǎo)致。De Wilde et al［14］對(duì)人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）誘導(dǎo)的致癌作用分析發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞株中hTERT啟動(dòng)子甲基化程度與腫瘤表型的進(jìn)展一致，但臨床樣本差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為hTERT啟動(dòng)子的高甲基化通過與抑制性轉(zhuǎn)錄因子作用，進(jìn)而影響hTERT基因的表達(dá)。Renaud et al［15］通過染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)hTERT基因的第一外顯子非甲基化時(shí)，與hTERT轉(zhuǎn)錄抑制因子CTCF結(jié)合并抑制hTERT的轉(zhuǎn)錄起始；而第一外顯子的調(diào)控序列發(fā)生甲基化時(shí)，CTCF不能與此結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，即解除CTCF對(duì)hTERT表達(dá)的抑制作用。從而推測hTERT啟動(dòng)子CpG島甲基化的主要目的可能是為了阻斷CTCF的結(jié)合，從而促進(jìn)hTERT的轉(zhuǎn)錄。Choi et al［16］應(yīng)用曲古柳菌素（Trichostatin A，TSA）下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT1）誘導(dǎo)hTERT啟動(dòng)子CpG島特定位點(diǎn)去甲基化，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)去甲基化區(qū)域有CTCF的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，位于CpG島的31st和33rd之間。當(dāng)TSA誘導(dǎo)CpG島特定位點(diǎn)的去甲基化時(shí)，促進(jìn)了CTCF與hTERT啟動(dòng)子上位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制hTERT的轉(zhuǎn)錄。然而，研究表明hTERT啟動(dòng)子完全甲基化明顯抑制hTERT轉(zhuǎn)錄，而啟動(dòng)子局部的低甲基化對(duì)hTERT的表達(dá)起關(guān)鍵作用。Zinn et al［17］研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中盡管hTERT啟動(dòng)子上游很多區(qū)域高度甲基化，但轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附件區(qū)域（－150～150 bp）的DNA低甲基化甚至非甲基化。如上所述，hTERT啟動(dòng)子甲基化作用與一般慣例不同。然而，對(duì)于啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)及部分區(qū)域低甲基化與hTERT表達(dá)的具體關(guān)系仍待深入研究。

2 組蛋白修飾

2.1 組蛋白乙?；M蛋白的乙酰化和去乙?；且粋€(gè)可逆的動(dòng)態(tài)過程，主要發(fā)生在組蛋白分子N端賴氨酸殘基上，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetylase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）調(diào)控。Choi et al［18］和Meeran et al［19－20］研究發(fā)現(xiàn)hTERT啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白在HAT的作用下發(fā)生乙酰化，可導(dǎo)致DNA空間結(jié)構(gòu)處于松弛狀態(tài)，從而有利于轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄效率大大提高，即組蛋白乙?；杉せ頷TERT基因的轉(zhuǎn)錄。相反，在HDAC作用下組蛋白去乙?；?，引起染色質(zhì)DNA高度凝縮，轉(zhuǎn)錄因子難于與之相應(yīng)的順式反應(yīng)元件結(jié)合，使hTERT轉(zhuǎn)錄受到抑制。Mao et al［21］研究表明NAD依賴性的組蛋白去乙酰化酶Sirt1與c-myc轉(zhuǎn)錄因子的C端相互作用，導(dǎo)致c-myc體外和體內(nèi)去乙?；?。而且這種脫乙酰化作用促進(jìn)c-myc與其活化分子MAX結(jié)合，從而促進(jìn)了hTERT啟動(dòng)子上c-myc的轉(zhuǎn)錄激活。Choi et al［16］又發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑（HDACi）增強(qiáng)了HAT共激活復(fù)合體將乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白賴氨酸Lys殘基的能力，導(dǎo)致核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)開放，從而激活或抑制hTERT等基因，最終促進(jìn)了不同轉(zhuǎn)錄因子如CTCF、c-myc及MAD1等與啟動(dòng)子結(jié)合。另也有研究［22］表明在正常細(xì)胞中TSA以Sp1依賴的方式誘導(dǎo)表達(dá)hTERT和端粒酶活性。

2.2 組蛋白甲基化有文獻(xiàn)報(bào)道另一重要形式組蛋白甲基化也調(diào)控hTERT表達(dá)。Atkinson et al［23］發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中H3-K4三甲基化激活hTERT基因轉(zhuǎn)錄。Liu et al［24］對(duì)腫瘤細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（SMYD3）在hTERT啟動(dòng)子調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。SMYD3使H3-K4發(fā)生三甲基化，募集HAT導(dǎo)致染色體構(gòu)象開放，從而有利于c-myc與Sp1結(jié)合；同時(shí)沉默SMYD3可減弱H3-K4甲基化和H3乙酰化，最終抑制hTERT轉(zhuǎn)錄及端粒酶活性。Ge et al［25］也發(fā)現(xiàn)DNA甲基化和組蛋白H3-K9修飾影響c-myc與hTERT啟動(dòng)子上E-box1位點(diǎn)結(jié)合，同時(shí)沉默c-myc明顯抑制hTERT表達(dá)。綜上所述，研究表明hTERT的表達(dá)可能是由表觀遺傳學(xué)（DNA甲基化和組蛋白修飾）及轉(zhuǎn)錄因子共同相互調(diào)控的結(jié)果。

3 非編碼RNA

3.1 microRNAsmicroRNAs也叫miRNAs或miRs，是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為20～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在細(xì)胞分化、生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。隨著非編碼RNA，尤其是microRNAs成為基因表達(dá)調(diào)控的研究熱點(diǎn)，其在hTERT表達(dá)調(diào)控中的作用也逐漸被認(rèn)識(shí)。

Mitomo et al［26］首次報(bào)道了與端粒酶活性相關(guān)的miRNAs。研究者選取并分析正常甲狀腺及甲狀腺癌細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs，最終較乳突狀甲狀腺癌相比，低分化型甲狀腺癌細(xì)胞中miR-138表達(dá)顯著下降。同時(shí)miRs在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-138的潛在靶點(diǎn)是hTERT。因此將miR-138前體分子轉(zhuǎn)入甲狀腺癌細(xì)胞中，應(yīng)用Western blot和熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測hTERT表達(dá)明顯下調(diào)。從而推測miR-138與hTERT mRNA的3＇UTR靶點(diǎn)結(jié)合抑制翻譯過程，進(jìn)而下調(diào)hTERT表達(dá)和抑制端粒酶活性。miRNAs的活性具有細(xì)胞特異性，除miR-138以外，其他miRNAs在其他組織細(xì)胞中也參與調(diào)控hTERT活性。Miura et al［27］研究表明人染色體10p可能含有調(diào)控hTERT表達(dá)的基因，從而應(yīng)用細(xì)菌人工染色體克隆研究發(fā)現(xiàn)與正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞中RGM249（編碼miRNAs的前體基因，位于10p15.3區(qū)）高表達(dá)，基本與hTERT表達(dá)一致；同時(shí)發(fā)現(xiàn)RGM249可顯著降低hTERT mRNA水平。另外，Wang et al［28］研究表明miR-21在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞增殖調(diào)控中起著十分重要的作用，并以STAT3依賴的方式調(diào)控hTERT表達(dá)影響細(xì)胞增殖。

3.2 長鏈非編碼RNA近年來研究［29］表明另一種非編碼RNA，TERRA（或TelRNA）參與端粒酶的調(diào)控。哺乳動(dòng)物的TERRA分子是一段含有UUAGGG重復(fù)序列，大小為100～9 000 bp的長鏈非編碼RNA。研究認(rèn)為TERRA可能以兩種方式抑制端粒酶活性，一種是與它的互補(bǔ)性序列作用阻滯RNA部分（hTR），另一種是影響端粒區(qū)的異染色質(zhì)［30］。而Redon et al［31］同時(shí)也發(fā)現(xiàn)TERRA也可以hTR非依賴形式與hTERT相互作用改變其結(jié)構(gòu)從而抑制端粒酶活性。目前研究結(jié)果僅提示，非編碼RNA可能對(duì)hTERT起到調(diào)控，但還未能闡明它們是通過何種機(jī)制來發(fā)揮調(diào)控作用，這有待進(jìn)一步探索。

4 前景與存在的問題

通過對(duì)腫瘤組織及細(xì)胞的研究，揭示了表觀遺傳學(xué)對(duì)hTERT基因表達(dá)的調(diào)控作用。這為進(jìn)一步研究腫瘤的發(fā)生機(jī)制及診斷治療方法提供新途徑。如Widschwendter et al［32］研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者h(yuǎn)TERT啟動(dòng)子甲基化的預(yù)后遠(yuǎn)差于未發(fā)生甲基化患者。但是調(diào)控hTERT表達(dá)是多重因素多種機(jī)制，未來還應(yīng)進(jìn)一步探討hTERT啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)與其表達(dá)之間的具體關(guān)系，microRNA與DNA甲基化和組蛋白修飾如何相互作用調(diào)控hTERT表達(dá)等。

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R 349.64

A

1000－1492（2014）04－0554－04

2013－10－28接收

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21272008、81072686、81273526）

安徽醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院、2肝病研究所，合肥 230032

吳小琴，女，碩士研究生；李 俊，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lj＠ahmu.edu.cn