黃 媛，張鵬程，楊 康，陳冬菊，劉文英，張 雷

（大理學院基礎醫(yī)學院，云南大理 671000）

大理單刺仙人掌提取物抑菌效果及抑菌機理的初步探討

黃 媛，張鵬程，楊 康，陳冬菊，劉文英，張 雷*

（大理學院基礎醫(yī)學院，云南大理 671000）

目的:探討大理地區(qū)單刺仙人掌乙醇提取物和超聲波提取物的體外抑菌效果及其抑菌機制。方法:以乙醇提取法和超聲波提取法提取仙人掌原液，用K-B法分別測仙人掌提取物對標準株金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白色念珠菌標準株的抑菌效果，以常量稀釋法檢測其最低抑菌濃度，并以抑菌曲線初步探討其抑菌機制。結果:兩種方法提取的仙人掌原液對實驗菌株均有抑制作用，乙醇提取物的最低抑菌濃度小于超聲波提取物。抑菌曲線表明，乙醇提取物原液在金黃色葡萄球菌生長的9 h內均表現(xiàn)出抑制作用。結論:大理地區(qū)的單刺仙人掌兩種提取物對本實驗的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌及真菌均有抑制作用，其中乙醇提取物的抑菌效果較超聲波提取物好。本研究可為仙人掌提取物的進一步研究和應用打下理論基礎。

單刺仙人掌提取物；K-B法；最低抑菌濃度（MIC）；抑菌曲線；抑菌效果；抑菌機理

近年來，隨著抗生素的不合理使用，臨床耐藥菌株不斷增加，細菌及真菌的耐藥性增強，致使臨床感染病死率不斷增高。我國中草藥資源豐富，種類繁多，許多中草藥具有抗細菌和真菌感染的藥效，且不易產生耐藥性，抗菌譜廣，毒副作用小，具有很好的發(fā)展前景〔1〕。在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學中，仙人掌類植物作為藥用已有悠久的歷史，并已作為中藥材列入我國《中藥大詞典》。仙人掌為健胃滋養(yǎng)強壯劑，又可以補脾、鎮(zhèn)咳、安神，治心胃氣痛、浮腫等〔2-3〕。本實驗以大理地區(qū)的單刺仙人掌（Opuntic monacantha）為原料，進行仙人掌粗提取物對幾種常見致病菌的抑菌作用和抑菌機制的初步研究，為開發(fā)和有效利用仙人掌資源奠定一定的基礎。

1 材料與儀器

1.1實驗菌株標準菌株為金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸埃希菌（ATCC25922）和白色念珠菌（ATCC90029）標準株；大理單刺仙人掌由小組成員赴大理市下關鳳儀鎮(zhèn)采集，并由大理學院藥化學院生藥教研室段寶忠副教授鑒定。

1.2實驗試劑營養(yǎng)瓊脂（批號：111007），MH瓊脂（批號：20021101），MH肉湯（批號：20020903），沙保弱培養(yǎng)基（批號：20070227）等；以上試劑均由杭州天和微生物試劑有限公司生產。

1.3主要儀器真空冷凍干燥器（日本EYELA東京理化器械株式會社，F(xiàn)DU-2100）；生化培養(yǎng)箱（常州維嘉儀器，WJ-250B）；高速中藥粉碎機（DFY-600）；低速平衡離心機（北京醫(yī)用離心機廠，LDZ5-2）；立式高壓滅菌器（上海博訊，YXQ-LS-50S）；旋轉蒸發(fā)儀（上海藍旭，RE-2000）；干燥箱（上海市崇明實驗儀器廠，101C-2CB）等。

2 實驗方法

2.1乙醇提取法制備仙人掌原液稱取2 kg大理單刺仙人掌，去刺洗凈切條后置于烘烤箱中60℃，96 h，烘干后粉碎。取仙人掌干粉100 g，加250 mL 80%的乙醇，充分振蕩，浸泡40 h后取上清液，濾渣中再加入150 mL 80%的乙醇，再次振蕩，浸泡48 h，取上清液，合并2次上清液后進行減壓抽濾，將濾液減壓濃縮后進行冷凍干燥，獲得仙人掌固體提取物10.61 g，密封儲存于4℃冰箱，備用〔4〕。

2.2超聲波提取法制備仙人掌原液取仙人掌粉末20 g用80%的乙醇以1 g∶20 mL的固液比例浸泡6 h，之后用超聲波（頻率70 kHz放射1 s，間歇1 s），作用于浸泡液20 min，過濾后，將濾渣再次加入80%乙醇400 mL，超聲波作用20 min，過濾，合并2次濾液，4℃冰箱過夜，次日用離心機4 500 r∕min，離心10 min，取上清液，真空冷凍干燥后，獲得超聲波仙人掌提取物3.45 g，密封儲存于4℃冰箱，備用〔5〕。

2.3藥物紙片制備將直徑為6.35 mm吸水量為20 μL的圓形濾紙片，放入EP管中置于立式高壓滅菌器中121℃下滅菌30 min后，制成含仙人掌提取物0.024 g的藥物濾紙片〔6〕。用75%乙醇浸泡的濾紙片作空白對照。

2.4體外抑菌試驗制備0.5麥氏單位的菌懸液，以K-B法〔7〕分別檢測仙人掌超聲波提取物和乙醇提取物對標準株ATCC 25293、ATCC25922、和ATCC90029的抑菌作用。

2.5最小抑菌濃度（MIC）測定采用常量稀釋法〔7-8〕，分別檢測仙人掌超聲波和乙醇提取物對標準株ATCC25293、ATCC25922和ATCC90029的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

2.6抑菌曲線的研究用MH液體培養(yǎng)基將仙人掌乙醇提取物稀釋成含生藥0.012 5 g∕mL，分別加入0.5麥氏單位的ATCC25293，使藥液含菌量為107CFU∕mL，置于搖床200 r∕min，37℃培養(yǎng)，對照（含ATCC25293）不加藥物培養(yǎng)。分別于0、3、6、9 h各取樣100 uL。用酶標儀分別檢測A600值，以A600作為縱坐標，以培養(yǎng)時間為橫坐標，利用Excel繪制仙人掌乙醇提取物對ATCC25293的抑菌曲線。

3 結果

3.1 K-B法檢測體外抑菌效果仙人掌乙醇提取物和超聲波提取物ATCC25923、ATCC25922和ATCC90029的體外抑菌結果表明：乙醇提取法優(yōu)于超聲波提取法；乙醇提取物對細菌的抑菌作用強于真菌。見表1。

表1 仙人掌80%的乙醇提取物與超聲波提取物抑菌效果

3.2常量稀釋法檢測MIC以常量稀釋法檢測仙人掌乙醇提取物和超聲波提取物對ATCC25923、ATCC25922和ATCC90029的MIC。結果表明：兩種仙人掌提取物均有抑菌效果，其中80%乙醇提取法所得提取物對金黃色葡萄球菌的MIC小于大腸埃希菌。見表2。

表2 仙人掌80%乙醇提取物與仙人掌超聲波提取物的MIC

3.3仙人掌提取物抑菌曲線繪制仙人掌80%乙醇提取物對ATCC25923的抑菌曲線，結果表明：仙人掌乙醇提取物在金黃色葡萄球菌生長的0～9 h均表現(xiàn)出抑制作用。見圖1。

圖1 仙人掌乙醇提取物對ATCC25923的抑菌曲線

4 討論

本研究選用金黃色葡萄球菌（ATCC25923）為革蘭陽性菌代表，大腸埃希菌標準株（ATCC25922）為革蘭陰性菌代表，選用白色念珠菌（ATCC90029）為真菌的代表，對仙人掌提取物的研究結果表明：乙醇提取物的抑菌效果比超聲波提取物好，兩種仙人掌提取物對實驗中的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌以及真菌均有抑菌活性，其中對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的抑制作用強于真菌，這與已有研究結果一致〔9-10〕。

天然產物提取物的抑菌機理主要為以下幾種類型：①抑制核酸的形成；②抑制蛋白質的合成；③改變細胞膜的通透性；④干擾細胞壁的形成；⑤作用于能量代謝系統(tǒng)和作為抗代謝物。對于作用于細胞壁的抗菌物質，微生物同樣也會產生一系列應激反應，已有研究發(fā)現(xiàn)真菌細胞在處理外界酶或其它環(huán)境因素（溫度、pH、化學物質、滲透壓等）對細胞壁的破壞作用時，可激活一系列酶反應，以檢測細胞壁受到的破壞并將其信息傳輸?shù)郊毎?，最后增加幾丁質合成，促進β-1，3葡聚糖聚合酶的表達，并促進細胞壁蛋白質的合成〔11〕。已知真菌細胞壁的主要成分是幾丁質，而細菌細胞壁主要成分是肽聚糖。當受到藥物作用時，真菌細胞可產生的應激反應，以增加幾丁質的合成，并促進真菌細胞壁的合成，增加真菌細胞壁的密度和厚度，這可能是導致本實驗中仙人掌提取物對真菌的抑制作用弱于細菌的原因。

在仙人掌抑菌曲線的研究中，發(fā)現(xiàn)乙醇提取物在金黃色葡萄球菌生長的0～9 h均表現(xiàn)出抑制作用，說明乙醇提取物在細菌生長的前期有一定的抑制作用。一般而言，細菌生長的前期包括遲緩期和對數(shù)期，遲緩期的細菌正在為下一步對數(shù)期的二分裂準備必須的酶及大分子前體物質，因而仙人掌乙醇提取物抑菌機制可能是由于其能抑制金黃色葡萄球菌在遲緩期的大分子前體物質的合成，并可能抑制或破壞進入對數(shù)期的菌體二分裂所需的蛋白或酶類，因而在細菌生長前期表現(xiàn)出抑制作用。本研究為仙人掌抑菌制品的進一步加工及其在藥用和仙人掌保健品開發(fā)方面提供了實踐依據(jù)。

感謝大理學院基礎醫(yī)學院病原生物學綜合實驗室孟余老師、藥化學院有機化學實驗室李龍星老師和段寶忠老師對本研究提供的幫助和支持。

〔1〕何明，張永跟.中藥抑菌作用研究現(xiàn)狀〔J〕.北京中醫(yī)藥大學學報：中醫(yī)臨床版，2007，14（6）:44-46.

〔2〕文雯，李梁.仙人掌的藥用功效及有效成分提取的研究進展〔J〕.保鮮與加工，2011，11（5）:47-50.

〔3〕楊寧.仙人掌多糖的分離純化及降血糖的研究〔D〕.廣東：華南理工大學，2007.

〔4〕趙聲蘭，陳朝銀，段家貴.仙人掌提取物的抑菌作用研究〔J〕.食品工業(yè)科技，2003，24（5）:40-43.

〔5〕韓淑琴.提取仙人掌抑菌物質三種方法的比較〔J〕.食品與藥品，2009，11（4）:41-43.

〔6〕繆曉平，鄧開野.仙人掌中抑菌活性成分的提取與分析〔J〕.河南工業(yè)大學學報，2010，31（6）:58-61.

〔7〕倪語星，尚紅.臨床微生物學與檢驗〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：58-63.

〔8〕孟小亮，田甜，賀中華，等.MIC法測定9種抗生素對不同血清型副溶血弧菌的抑菌作用〔J〕.齊魯漁業(yè)，2009（6）：23-25.

〔9〕姜成，申曉慧，李春豐，等.仙人掌提取物抑菌作用的研究〔J〕.內蒙古農業(yè)科技，2013（3）:38-39.

〔10〕余中華，趙超，賈德峰，等.仙人掌不同提取物的抑菌效果〔J〕.熱帶作物學報，2008，29（2）:237-242.

〔11〕KAPTEYN J C，VAN DEN ENDE H，KLIS F M.The con?tribution of cell wall proteins to the organization of the yeast cell wall〔J〕.Biochim Biophys Acta，1999，1426（2）:373-83.

*通信作者：張雷，教授，博士.

（責任編輯 李 楊）

Preliminary Study on the Antibacterial Effects and Mechanism of Opuntia monacantha Extracts in Dali

HUANG Yuan,ZHANG Pengcheng,YANG Kang,CHEN Dongju,LIU Wenying,ZHANG Lei*
（Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the antibacterial effects and mechanism in vitro of the ethanol extracts and ultrasonic extracts of Opuntic monacantha in Dali.Methods:Ethanol extraction and ultrasonic extraction were respectively applied to the preparation of primary extracts of Opuntia monacantha,and antibacterial effects on experimental strains Staphylococcus aureus,Escherichia coli and Candida albicans were detected by using K-B method.The minimum inhibitory concentrations(MIC)were measured by the macro dilution method,and the antibacterial mechanism was preliminarily explored by the antibacterial curve.Results:There are inhibitory effects in two kinds of primary extracts on experimental strains.The MIC of ethanol extracts were lower than that of ultrasonic extracts. Antibacterial curve demonstrated that the ethanol extracts of Opuntic monacantha had antibacterial effects on Staphylococcus aureus within 9 hours of growth.Conclusion:Two kinds of extracts of Opuntic monacantha in Dali were able to inhibit the growth of experimental strains including gram-negative and gram-positive bacteria and fungi;antimicrobial effects of ethanol extracts were better than those of ultrasonic extracts.This study could provide a theoretic basis for further research on and application of the extracts of Opuntia monacantha.

Opuntia monacantha extracts;K-B method;minimum inhibition concentration(MIC);antibacterial curve;antimicrobial effect;antibacterial mechanism

S682.33

A

1672-2345（2014）08-0015-03

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.08.005

大理學院大學生科研基金資助項目（KYSX2012004）

2014-03-06

2014-04-18

黃媛，臨床醫(yī)學專業(yè)2010級本科生.