許益聘 林和敏 譚健 韓芳 劉廣鵬 葉信海

【摘要】目的 觀察自體脂肪干細(xì)胞（adipose-deRived stem cells， ASCs）移植對雙側(cè)卵巢切除術(shù)后骨質(zhì)疏松（ovaRiectomy osteopoRosis， OVX-OP）兔的影響。方法 15 只成年新西蘭雌性大白兔隨機(jī)分為OVX模型組（A組，n=12）與假手術(shù)組（B組，n=3）。A組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，B組行假手術(shù)。術(shù)后6 個月，A、B組行雙能量X線吸收測定（dual eneRgy X-Ray absoRptiometRy， DXA）檢測骨密度（bone mineRal density， BMD），驗(yàn)證造模效果。取OP兔皮下脂肪，體外培養(yǎng)并成骨誘導(dǎo)ASCs，行細(xì)胞計(jì)數(shù)，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）、茜素紅染色及骨鈣素（osteocalcin， OCN）等檢測。取第3 代成骨誘導(dǎo)ASCs復(fù)合藻酸鈣凝膠（calcium alginate hydRogel， CAH），于OP模型兔左側(cè)股骨遠(yuǎn)端注射ASCs-CAH，而右側(cè)股骨注射單純CAH材料作為治療對照組。移植12 周后作骨密度測定、MicRo-CT檢測及骨組織形態(tài)學(xué)分析。結(jié)果 與B組相比，A組股骨骨密度明顯降低（P<0，05），證實(shí)OVX造模成功；體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的ASCs細(xì)胞計(jì)數(shù)與未誘導(dǎo)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0，05），而ALP、OCN檢測及茜素紅染色證實(shí)ASCs已分化為成骨細(xì)胞；自體細(xì)胞移植治療12 周后，與對照組相比，細(xì)胞治療組股骨遠(yuǎn)端骨密度、骨小梁數(shù)量、厚度、分離度及結(jié)構(gòu)模型指數(shù)均明顯改善（P<0，05）。組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組骨小梁厚度增寬，植入的CAH材料已降解完全，而對照組骨小梁較纖細(xì)，CAH材料有部分殘留。結(jié)論 ASCs自體移植對兔OP有一定的治療效果，為OP治療提供新思路。

【關(guān)鍵詞】脂肪干細(xì)胞；骨質(zhì)疏松；卵巢切除術(shù)；兔；藻酸鈣凝膠

Effects of tRansplantation of autologous adipose-deRived stem cells on osteopoRosis in a Rabbit ovaRiectomy model Xu Yipin， Lin Hemin， Tan Jian， Han Fang， Liu Guangpeng， Ye Xinhai. DepaRtment of Plastic SuRgeRy， Shanghai Tenth People s Hospital， Tongji UniveRsity， Shanghai 200072， China

CoRResponding authoRs：Ye Xinhai， Email： dRyxh@189，cn；Liu Guangpeng， Email： guangpengliu@163，com

【AbstRact】Objective To obseRve the effects of tRansplantation of autologous adipose-deRived stem cells （ASCs） on osteopoRosis （OP） in a Rabbit ovaRiectomy （OVX） model.Methods A total of fifteen 6-month-old female New Zealand white Rabbits weRe Randomly divided into two gRoups： ovaRiectomy gRoup （gRoup A， n=12） and sham opeRation gRoup （gRoup B， n=3）. All Rabbits weRe subjected to bilateRal ovaRiectomy in the gRoup A. Six months lateR， bone mineRal density （BMD） of gRoup A and gRoup B weRe measuRed by dual eneRgy X-Ray absoRptiometRy （DXA） to check the Result of OVX-OP. ASCs haRvested fRom adipose of OP Rabbits weRe cultuRed to be expanded and diffeRentiated in osteogenic medium in vitRo. Osteogenesis was evaluated by alizaRin Red staining， alkaline phosphatase （ALP） staining and quantitative assays of osteocalcin （OCN）. Autologous osteo-induced ASCs weRe mixed in calcium alginate hydRogel （CAH） and then tRansplanted in the left distal femuRs， while CAH was tRansplanted in the Right distal femuRs of OP Rabbits. At 12 weeks afteR implantation， BMD， micRo-CT and histomoRphological analyses weRe peRfoRmed on these Rabbits.Results The BMD of femuRs in gRoup A Rabbits weRe obviously loweR than that of gRoup B Rabbits （P<0，05） at 6 months afteR OVX. CompaRed with contRol gRoup， ASCs cultuRed in osteo-induction medium had similaR pRolifeRation Rate as the non-induced cells， but displayed positive ALP and alizaRin Red staining and OCN contents. At 12 weeks afteR implantation， the cell-tReated femuRs displayed higheR BMD， bone tRabecula numbeR， tRabecula thickness and sepaRation than those of contRol gRoup， while the stRuctuRe model index and poRosity weRe loweR （P<0，05）. Histological examination indicated that the tRabeculaR thickness incReased with complete CAH ResoRption in cell-tReated gRoup， while CAH Remained in contRol gRoup.Conclusions TRansplantation of autologous ASCs can help stRengthen osteopoRotic bone in OVX-OP Rabbits， pRoviding a novel appRoach to OP tReatment.

【Key woRds】Adipose-deRived stem cell； OsteopoRosis； OvaRiectomy； Rabbit； Calcium alginate hydRogel

骨質(zhì)疏松（osteopoRosis，OP）是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的，致使骨的脆性增加以及易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病[1]。隨著社會老齡化的進(jìn)展，OP的發(fā)病率正逐年提高。因此，研究OP的治療方法具有重要的臨床價(jià)值。干細(xì)胞技術(shù)和組織工程的興起為OP治療提供了一個新的思路。2001年Zuk等[2]于脂肪組織中首先發(fā)現(xiàn)了脂肪干細(xì)胞（adipose-deRived stem cells，ASCs），其在特定誘導(dǎo)條件下能向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多向分化[3-5]，并且具有分離方法簡單、增殖快速等優(yōu)點(diǎn)，因此對ASCs的研究日益受到重視[6-10]。李慧武等[11]報(bào)道，成骨誘導(dǎo)分化的ASCs可以修復(fù)骨缺損，但應(yīng)用ASCs治療骨質(zhì)疏松的研究尚未見報(bào)道。因此在本研究中，筆者設(shè)想經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)分化的ASCs自體移植可改善骨質(zhì)疏松的骨密度及骨組織微結(jié)構(gòu)，并開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。

1 材料與方法

1，1 實(shí)驗(yàn)動物和分組

選用6 個月齡雌性新西蘭白兔15 只，2，5～3，5 kg，由上海市第十人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。兔子適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為模型組（A組，n=12）和假手術(shù)組（B組，n=3）。

1，2 主要試劑和儀器

戊巴比妥鈉粉劑、藻酸鈉、BM-PuRple染色劑、地塞米松、β-磷酸甘油鈉和L-2-磷酸抗壞血酸購于美國Sigma公司；骨鈣素檢測試劑盒（osteocalcin， OCN）購于美國BiosouRce公司；鼠抗人I型膠原酶購于美國WoRthington公司；低糖DMEM粉劑、胎牛血清均購于美國Gibco公司；胰蛋白酶購于上海思吉生物制品有限公司；硫酸鈣購于上海國藥公司；HEPES購于上海浩然生物技術(shù)有限公司。

雙能X-線骨密度儀（XR-36 DEXA）（美國NoR-land公司）；恒溫CO₂培養(yǎng)箱（美國FoRma公司）；普通臺式離心機(jī)（美國HeRaeus）；倒置相差顯微鏡（美國Nikon公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國Beckman CoulteR公司）；MicRo CT（瑞士Scanco公司）。

1，3 去勢法建立兔OP模型

實(shí)驗(yàn)兔給予2 mL/kg戊巴比妥鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%）肌注麻醉后，在無菌條件下由正中切開腹腔，A組兔切除雙側(cè)卵巢，探查無活動性出血后關(guān)閉腹腔；B組為假手術(shù)組，即打開腹腔，找到雙側(cè)卵巢及輸卵管后即關(guān)閉腹腔。手術(shù)后安置在飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對濕度為40%～50%環(huán)境中。術(shù)后6 個月，應(yīng)用DXA對A組和B組兔雙側(cè)股骨遠(yuǎn)端（末端向上10 mm）測量BMD，以判斷OP模型的建立是否成功。

1，4 OP兔的ASCs體外培養(yǎng)與成骨分化

ASCs的分離、培養(yǎng)與體外擴(kuò)增采用文獻(xiàn)[2]的方法。待OP模型建立成功后，在2 mL/kg戊巴比妥鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%）肌注麻醉下，剪取造模組兔子頸背部皮下脂肪組織約10 g，PBS液沖洗3次以去除肉眼可見的小血管和血液，剪碎至1 mm3，加入2倍體積的0，15% I型膠原酶，攪拌混勻消化。40 min后加入同體積的含10%胎牛血清的低糖DMEM中和膠原酶，1000 R/min離心8 min。去除上清，再用含10%胎牛血清的低糖DMEM（基礎(chǔ)培養(yǎng)液）重懸細(xì)胞，200 目尼龍濾網(wǎng)過濾，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后以1×104/cm2的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，放置于37 ℃、5% CO₂二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后首次換液，之后每2～3 d換液1 次。光學(xué)倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況，待細(xì)胞融合至瓶底80%以上利用0，25%胰蛋白酶以1∶3進(jìn)行傳代。在第3 代細(xì)胞中加入含有地塞米松（5 nmol/L）、β-磷酸甘油鈉（10 mmol/L）和L-2-磷酸抗壞血酸（50 μmol/L）的DMEM培養(yǎng)液（成骨誘導(dǎo)液）進(jìn)行體外誘導(dǎo)[3]，同時以加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液作為陰性對照，每2～3 d換液1 次。成骨誘導(dǎo)第14 天分別利用BM-PuRple染色、茜素紅染色檢測堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）表達(dá)和鈣結(jié)節(jié)形成。另外，在成骨誘導(dǎo)第3、6、9、12、15、18 天將細(xì)胞消化離心，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，并采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中OCN的含量。

1，5 自體ASCs-藻酸鈣（adipose deRived stem cells-calcium alginate hydRogel， ASCs-CAH）復(fù)合物的制備與回植

2，282 g K2HPO4和0，790 g NaCl加入100 mL雙蒸水中，pH 7，4，配制成0，1 mol/L NaCl貯存液。100 mL貯存液中加入1，5 g高純度的藻酸鈉，置于磁力攪拌器上，攪拌6 h至完全溶解。將配制好的溶液，過0，22 μm的濾器，變成無菌，4 ℃保存。

常規(guī)胰酶消化收集第3 代細(xì)胞，取200×106個細(xì)胞與藻酸鈉混合，細(xì)胞終質(zhì)量濃度為50×106個/mL，每毫升細(xì)胞-藻酸鈉懸液與0，2 g硫酸鈣混合，形成凝膠狀復(fù)合物。取0，5 mL ASCs-CAH復(fù)合物注射至自體OP兔左側(cè)股骨遠(yuǎn)端內(nèi)側(cè)髁部，右側(cè)則注射單純CAH作為對照組。

移植第12 周時，采用空氣栓塞處死法處死實(shí)驗(yàn)動物，獲取股骨標(biāo)本，行MicRo CT檢測，并利用儀器自帶軟件測定股骨遠(yuǎn)端BMD及骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)。標(biāo)本經(jīng)脫鈣處理后，行HE染色觀察組織學(xué)變化。

1，6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13，0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異采用成組t檢驗(yàn)進(jìn)行判斷。以P<0，05為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2，1 造模骨密度測定

OVX術(shù)后6 個月，隨機(jī)抽取造模組3只兔子（共6側(cè)股骨），與假手術(shù)組相比，造模組股骨骨密度明顯降低[（323，8±9，5） mg/cm2 vs. （312，8±6 ） mg/cm2]，證實(shí)造模成功。

2，2 ASCs的體外增殖與成骨分化

本實(shí)驗(yàn)采文獻(xiàn)[2，6]經(jīng)典方法體外培養(yǎng)ASCs。光學(xué)倒置相差顯微鏡觀察，初分離的ASCs接種4 h后，已開始貼壁生長（圖1A）。第3 代ASCs仍保持成纖維細(xì)胞樣形態(tài)和旺盛的增殖能力（圖1B）。成骨誘導(dǎo)第14 天的細(xì)胞ALP染色可見藍(lán)色顆粒（陽性）（圖1D），而對照組為陰性（圖1C）；茜素紅染色誘導(dǎo)組細(xì)胞可見紅色鈣化結(jié)節(jié)（陽性）（圖1F），而對照孔無鈣化現(xiàn)象（圖1E）。經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，第3 代細(xì)胞保持良好的生長能力。細(xì)胞增殖曲線與對照組相比，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0，05），見圖2。OCN定量測定結(jié)果顯示隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的延長，OCN含量逐漸增高，從第12 天起誘導(dǎo)組顯著高于對照組（P<0，05），圖3。結(jié)合ALP與茜素紅染色的結(jié)果，表明ASCs已誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。

2，3 MicRo-CT測定

細(xì)胞移植12 周后，與對照組相比，細(xì)胞治療組股骨遠(yuǎn)端骨密度、骨小梁的數(shù)量、厚度均顯著升高（P<0，01），骨小梁的分離度和結(jié)構(gòu)模型指數(shù)明顯降低（P<0，05），見表1。二維掃描結(jié)果示，對照組骨小梁數(shù)量較少，排列紊亂，骨小梁間出現(xiàn)斷裂，間距增大（圖4A），而細(xì)胞治療組骨小梁數(shù)量較多，排列較有序（圖4B）；三維重建圖像示，對照組骨小梁較稀疏，骨小梁間距較大（圖4C），而細(xì)胞治療組的骨小梁較為致密（圖4D）。

A：原代細(xì)胞接種第1天；B：P3代細(xì)胞接種第3天；C：未誘導(dǎo)組細(xì)胞BM-puRple染色；D：成骨誘導(dǎo)組BM-puRple染色；E：未誘導(dǎo)組細(xì)胞茜素紅染色；F：成骨誘導(dǎo)組茜素紅染色

2，4 骨組織微結(jié)構(gòu)變化

ASCs移植治療第12 周時，HE染色示細(xì)胞治療組骨小梁數(shù)量較多，厚度較寬，髓腔內(nèi)未見材料殘留，而對照組骨小梁數(shù)量稀少，厚度較薄，可見CAH材料的殘余成分（圖5）。

3 討論

去勢法骨質(zhì)疏松模型的建立是一個較為成熟的方法[12-17]，一般兔在摘除雙側(cè)卵巢3 個月后即可建立骨質(zhì)疏松模型。骨密度是反映骨量變化和骨質(zhì)疏松程度的一個重要指標(biāo)。李偉等[16]研究證實(shí)骨質(zhì)疏松都伴有骨小梁的吸收，隨之引起股骨疏松。因此股骨骨密度可以反映全身的骨質(zhì)變化情況。本實(shí)驗(yàn)在切除雙側(cè)卵巢后6 個月發(fā)現(xiàn)，造模組股骨骨密度明顯低于假手術(shù)組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0，05），與上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致，證實(shí)了利用去勢法建立兔骨質(zhì)疏松模型的可行性。

干細(xì)胞與組織工程技術(shù)的興起為骨質(zhì)疏松的治療提供一種思路。2001 年Zuk[2]于脂肪組織中發(fā)現(xiàn)了具有貼壁生長特性的間質(zhì)細(xì)胞，通過對其表面抗原與多項(xiàng)分化能力進(jìn)行鑒定，證實(shí)從脂肪組織中獲得的貼壁細(xì)胞即為ASCs。ASCs具有細(xì)胞來源廣泛、分離培養(yǎng)簡單、低免疫原性、多種分化潛能等。本實(shí)驗(yàn)采用該經(jīng)典方法，從OP造模的兔皮下脂肪組織中獲得貼壁生長的ASCs，經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后仍能保持活躍的增殖能力，同時對其進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化鑒定，證實(shí)ASCs能夠向成骨細(xì)胞定向分化。

自體ASCs移植治療12 周后，與對照組相比，細(xì)胞治療組股骨遠(yuǎn)端骨密度及骨組織形態(tài)學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)均明顯改善。組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞治療組骨小梁厚度較對照組增寬，植入的CAH已降解完全，而對照組骨小梁較纖細(xì)，CAH仍有部分殘留。本實(shí)驗(yàn)表明ASCs可促進(jìn)骨礦化，增加骨量，并促進(jìn)新生骨小梁形成，從而達(dá)到提高骨密度、改善骨組織微結(jié)構(gòu)的目的，表明ASCs-CAH移植對OP有一定的治療作用。

作為自體ASCs的載體，CAH是一種可注射的、具有良好的生物相容性和可降解性的的支架材料[18]，可為成骨細(xì)胞提供三維空間結(jié)構(gòu)。而且在組織工程技術(shù)構(gòu)建骨組織過程中，可提供骨形成過程中所必需的鈣離子，有利于新骨形成。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ASCs-CAH移植12 周后，與對照組相比，細(xì)胞治療組的股骨骨密度、骨組織微結(jié)構(gòu)均明顯改善且材料降解吸收加快，表明CAH具有良好的細(xì)胞相容性，是比較理想的細(xì)胞載體。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明OP造模后的兔ASCs能夠向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，ASCs-CAH移植對OP具有一定的治療作用，能夠促進(jìn)新骨形成，增加骨密度，改善骨組織微結(jié)構(gòu)，從而為利用組織工程技術(shù)治療OP提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2013-06-21）

（本文編輯：邵菊芳）

DOI：10，3760/cma，j，issn，1671-0282，2014，01，014

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81171475，31271027）

作者單位：200072 上海，上海市第十人民醫(yī)院整形外科（許益聘、譚健、韓芳、劉廣鵬、葉信海）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院整形外科（林和敏）

通信作者：葉信海，Email：dRyxh@189，cn；劉廣鵬，Email：guangpengliu@163，com

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