劉衍恭 劉 剛 王 普 鄭明奇

心臟氧化還原系統(tǒng)對(duì)鈉鈣處理蛋白的調(diào)控機(jī)制

劉衍恭 劉 剛 王 普 鄭明奇△

氧化應(yīng)激引起的心臟收縮功能障礙和心律失常均源于細(xì)胞內(nèi)外鈉鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡,其潛在的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)控機(jī)制除了經(jīng)典途徑，如通過(guò)調(diào)控蛋白激酶A、蛋白激酶C和鈣離子∕鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ等蛋白激酶使之活化外；近來(lái)愈來(lái)愈多的證據(jù)顯示氧化應(yīng)激時(shí)活性氧自由基也能夠直接氧化這些激酶或者鈉鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和離子通道，從而改變其作用，導(dǎo)致心律失常發(fā)生。

氧化應(yīng)激；鈉鈣處理；活性氧自由基；氧化還原系統(tǒng)；心律失常

心臟的收縮功能障礙和心律失常均源于細(xì)胞內(nèi)鈉鈣離子處理障礙[1]。其經(jīng)典的調(diào)控機(jī)制包括許多影響鈉鈣調(diào)控的蛋白信號(hào)途徑，如應(yīng)激活化的蛋白激酶，包括蛋白激酶A （PKA）、蛋白激酶C（PKC）和鈣離子∕鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）。同時(shí)，愈來(lái)愈多的證據(jù)顯示活性氧自由基（ROS）能夠直接氧化這些激酶，從而改變其作用。當(dāng)心臟處于疾患狀態(tài)時(shí)，ROS生成增多，一方面激活絲氨酸∕蘇氨酸激酶，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡；另一方面通過(guò)氧化和激活離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如電壓門控鈉通道、Na+∕K+-ATP酶（NKA）、鈉鈣交換蛋白（NCX）、L型鈣離子通道、蘭尼堿受體（RyR2）及肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子ATP酶（SERCA2a），引起鈉鈣失衡，促進(jìn)心律失常發(fā)生。本文就細(xì)胞內(nèi)鈉鈣處理蛋白的氧化還原調(diào)控機(jī)制綜述如下。

1 心臟的氧化還原系統(tǒng)

心臟的氧化還原系統(tǒng)是由生成ROS的蛋白系統(tǒng)和抗氧化的蛋白系統(tǒng)組成的微妙平衡。

1.1 心臟的ROS來(lái)源和抗氧化能力 ROS的細(xì)胞內(nèi)來(lái)源包括線粒體、NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶和非偶聯(lián)的一氧化氮合成酶（NOS）。生理?xiàng)l件下，線粒體內(nèi)氧化磷酸化可產(chǎn)生少量超氧化物（O2-），其又可以被超氧化物歧化酶（SOD）失活變成H2O2。O2-由于其高活性只能擴(kuò)散幾個(gè)納米的有限距離，而H2O2的低活性可以允許其擴(kuò)散至細(xì)胞膜。H2O2自身可被谷胱甘肽過(guò)氧化酶、過(guò)氧化氫酶和硫氧還蛋白（Trx）系統(tǒng)還原成H2O。谷胱甘肽過(guò)氧化酶大量存在于線粒體和胞質(zhì)中，其活性需要谷胱甘肽的存在，而谷胱甘肽是胞質(zhì)內(nèi)主要的氧化還原緩沖物質(zhì)。還原型與氧化型谷胱甘肽的比率通常大于10，但在病理?xiàng)l件下會(huì)顯著降低[2]。當(dāng)超氧化物增加時(shí)，隨之產(chǎn)生大量的H2O2使細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力大大削弱，同時(shí)也可以產(chǎn)生大量高反應(yīng)性的OH-自由基或者過(guò)氧化亞硝酸基（ONOO-）[3]。

除了在線粒體可以大量生成O2-外，在心肌細(xì)胞因富含NADPH氧化酶（Nox2和Nox4）也能產(chǎn)生O2-。研究顯示在心臟氧化應(yīng)激（機(jī)械張力、內(nèi)皮素-1、血管緊張素Ⅱ）的條件下，Nox活性是增加的，且與線粒體內(nèi)的ROS產(chǎn)物密切相關(guān)[4]。Nox依存的ROS產(chǎn)生在線粒體內(nèi)能夠以ROS誘發(fā)ROS釋放的正反饋方式大量擴(kuò)增。雖然目前Nox4的作用還不太清楚，但越來(lái)越多的證據(jù)顯示Nox4的上調(diào)控及其大量轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)，能顯著增加ROS的產(chǎn)生，加重心肌功能障礙和心律失常發(fā)生。但也有研究顯示基因敲除Nox能夠使心臟功能障礙進(jìn)一步加重，這可能是Nox4在血管形成中具有有益作用[5]，但內(nèi)在機(jī)制尚不清楚。

ROS的第3種來(lái)源是黃嘌呤氧化酶，在心功能不全時(shí)其活性和表達(dá)會(huì)增加。此外，還有NOS，在氧化應(yīng)激時(shí)其結(jié)構(gòu)會(huì)變得不穩(wěn)定，產(chǎn)生ROS（NOS的非偶聯(lián)作用）。這種作用在壓力超負(fù)荷時(shí)影響心臟重構(gòu)。特別注意的是，內(nèi)皮型NOS （eNOS）常和L型鈣離子通道共存于細(xì)胞膜小凹中，而神經(jīng)型NOS（nNOS）則和RyR2共存于肌漿網(wǎng)上。這暗示了NOS 在ROS依存性的鈣離子處理中扮演著重要的角色[6]。由于ROS的半衰期極短，對(duì)離子通道蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用因ROS產(chǎn)生的來(lái)源和部位不同而有差別。

1.2 蛋白的氧化還原調(diào)控 ROS氧化半胱氨酸的巰基團(tuán)（SH-），生成二硫基團(tuán)，從而影響蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，改變通道蛋白的性狀和功能。研究已經(jīng)顯示許多鈣調(diào)節(jié)蛋白在生理或病理?xiàng)l件下受到ROS依存性的氧化而發(fā)生功能變化[7]。

2 絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶的氧化還原調(diào)控

高活性的ROS在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散距離非常有限。因此內(nèi)源性ROS只能影響鄰近的靶目標(biāo)，產(chǎn)生的作用很局限。另一方面，ROS能夠?qū)π募〖?xì)胞產(chǎn)生廣泛的影響，對(duì)這種矛盾的一種解釋是ROS依存的Ser∕Thr的活化作用所致，使這些酶能夠位移，磷酸化鈣調(diào)節(jié)蛋白，最終導(dǎo)致諸多活性改變。

2.1 CaMKⅡ CaMKⅡ?qū)?xì)胞內(nèi)鈣離子和興奮收縮偶聯(lián)有重要的調(diào)控作用。CaMKⅡ是一種Ser∕Thr激酶，在心臟組織大量表達(dá)。CaMKⅡ能磷酸化多種鈣調(diào)節(jié)蛋白，包括L型鈣通道、RyR2和受磷蛋白（PLN）[8]。另外，CaMKⅡ能磷酸化心肌鈉通道，增加晚鈉內(nèi)流，延長(zhǎng)動(dòng)作電位間期（APD）。

典型CaMKⅡ活化是鈣離子依賴性的。鈣離子先共價(jià)結(jié)合于鈣調(diào)蛋白（Ca-CaM），然后一起結(jié)合到CaMKⅡ的調(diào)控區(qū)域，消除調(diào)控區(qū)域?qū)Υ呋瘏^(qū)域的自動(dòng)抑制作用，使靶蛋白磷酸化。激活后，即使Ca-CaM與調(diào)控區(qū)域分離，Ser286或287亞單位自身也可發(fā)生磷酸化，繼續(xù)消除調(diào)控區(qū)域?qū)Υ呋瘏^(qū)域的抑制作用。因此，Ser286自身磷酸化能夠產(chǎn)生持續(xù)的自發(fā)活性。通過(guò)整合胞內(nèi)快速瞬間鈣濃度的變化，Thr286自身磷酸化是CaMKⅡ?qū)︹}的記憶。

另一種新穎的非鈣依賴性CaMKⅡ的活化機(jī)制闡述了ROS氧化調(diào)控區(qū)域的蛋氨酸281∕282，產(chǎn)生與Thr286自身磷酸化相似的活化模式(非Ca-CaM依賴活化)[9]。例如，通過(guò)血管緊張素Ⅱ與心肌細(xì)胞上的受體結(jié)合刺激NADPH氧化酶2可產(chǎn)生這種形式的活化作用。蛋氨酸281∕282的氧化是一種可逆過(guò)程。蛋氨酸硫化物還原酶A可使被氧化的蛋氨酸還原。在病理生理學(xué)上，CaMKⅡ被氧化與竇房結(jié)功能障礙和醛固酮誘導(dǎo)的心臟損傷有關(guān)。

2.2 PKA 兒茶酚胺結(jié)合到G蛋白偶聯(lián)的β受體，激活腺苷酸環(huán)化酶，增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP），進(jìn)而活化PKA。PKA有2種形式：PKAⅠ和PKAⅡ，均為包含2個(gè)催化亞基和調(diào)節(jié)亞基的四聚體。調(diào)節(jié)亞基與PKA錨定蛋白（AKAP）結(jié)合，使PKA移向它的底物蛋白。兩分子的cAMP與各自的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合使PKA產(chǎn)生活化作用，有利于催化亞基和調(diào)節(jié)亞基的分離，導(dǎo)致底物磷酸化。眾所周知，PKA能夠使一些鈣調(diào)節(jié)蛋白磷酸化，包括RyR2、L型鈣通道和PLN[10]。另外PKA使肌鈣蛋白Ⅰ磷酸化，能夠調(diào)節(jié)肌絲對(duì)鈣離子的敏感性。

PKA調(diào)節(jié)亞基包括2種亞型：RⅠ型和RⅡ型。RⅠ型存在于胞液中，而RⅡ型位于細(xì)胞內(nèi)膜，其靶目標(biāo)是AKAP。肽類底物使RⅠ型在低濃度下活化，生理濃度的cAMP通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)取代RⅠ型亞基。RⅡ型不具有這種底物誘導(dǎo)敏感性的作用。RⅠ型易被ROS氧化，將2個(gè)調(diào)節(jié)亞基之間的半胱氨酸17和38的氧化形成二硫化物，使PKA全酶復(fù)合體分離。RⅠ型的移位（從細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜和肌絲）和激活引起細(xì)胞收縮性增加，而無(wú)需cAMP增加。被氧化的RⅠ型的移位對(duì)活化有利，是因?yàn)樗子谂c底物結(jié)合。

2.3 PKC 根據(jù)PKC的活化特征，將12種PKC同工酶分為3類：傳統(tǒng)的PKC同工酶（α、βⅠ、βⅡ和γ），可被鈣離子和甘油二酯（DAG）活化；新型的同工酶(δ、ε、θ和η）和不典型的同工酶（ξ和λ）是非鈣離子依賴性的，可被脂類活化。PKC由N末端調(diào)節(jié)亞基和C末端催化亞基組成。PKC失活時(shí)，調(diào)節(jié)亞基與催化亞基結(jié)合?；罨蜃樱―AG和鈣離子）致PKC構(gòu)象發(fā)生改變，引起酶自身抑制解除和活化開始，甚至能促使PKC位移至胞膜進(jìn)一步增強(qiáng)其活化效果，然后，活化的PKC與細(xì)胞內(nèi)受體蛋白結(jié)合發(fā)揮作用。PKC上的結(jié)合位點(diǎn)是由底物的結(jié)合位點(diǎn)決定的，而DAG能進(jìn)一步增加結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目。這些受體蛋白被稱為活化激酶C受體，在誘導(dǎo)活化PKC位移中起重要作用。

PKC活化的效果是復(fù)雜多樣的，特別是幾種同工酶同時(shí)活化時(shí)，其效果會(huì)相互依存，交叉疊加。細(xì)胞內(nèi)各個(gè)同工酶的活性依賴于它們的表達(dá)水平、基質(zhì)位置和磷酸化狀態(tài)。因種屬和細(xì)胞類型的差異，PKC同工酶的作用也各不相同。這也許可以解釋使用基因敲除法敲除一種PKC同工酶后，經(jīng)常會(huì)表現(xiàn)出不相一致的結(jié)果。但總體來(lái)說(shuō)，G蛋白偶聯(lián)受體激動(dòng)劑（異丙腎上腺素和血管緊張素Ⅱ）和機(jī)械牽張都可以通過(guò)激活PKC使心肌肥大。在心肌肥厚的在體模型中，PKCα和PKCβ表達(dá)上調(diào)，PKCε不僅表達(dá)上調(diào)而且優(yōu)先活化，而PKCδ、λ或ξ表達(dá)水平并沒(méi)有變化[11]。另外，在心肌缺血的預(yù)適應(yīng)中PKCδ和PKCε作用相反。

PKC可調(diào)控興奮收縮偶聯(lián)。PKCα能夠增強(qiáng)蛋白磷酸酶1的活性，引起PLN脫磷化和降低SERCA2a活性。PKCα或PKCβ能夠磷酸化肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T、肌聯(lián)蛋白和肌球蛋白結(jié)合蛋白C，致使肌絲對(duì)鈣的敏感性下降。同時(shí)PKCα、PKCβⅠ、βⅡ和PKCγ能夠使L型鈣通道的α1c亞基磷酸化。

研究顯示氧化應(yīng)激也能激活PKC。高濃度的ROS （5 mmol∕L H2O2）能同時(shí)氧化PKC的催化亞基和調(diào)控亞基，引起激酶不可逆性失活。而低濃度ROS（50 mmol∕L H2O2）僅氧化PKC調(diào)控亞基，產(chǎn)生非鈣離子和磷脂依賴性的活化[12]。這種新型病理生理相關(guān)的氧化還原依賴的PKC激活機(jī)制目前不太清楚。

3 鈉鈣處理蛋白的氧化還原調(diào)控

ROS的蓄積可以引起細(xì)胞內(nèi)鈉離子和鈣離子超載，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈉超載會(huì)極大增強(qiáng)線粒體ROS的產(chǎn)生。這種正反饋環(huán)極大地加重了ROS所導(dǎo)致的損害。細(xì)胞內(nèi)鈉鈣的穩(wěn)態(tài)是緊密相關(guān)的，改變鈉處理蛋白不僅改變細(xì)胞內(nèi)鈉含量，也能影響細(xì)胞內(nèi)鈣含量及心肌收縮性。

3.1 電壓門控鈉通道 心肌鈉通道由主孔道α亞基(Nav1.5)及調(diào)節(jié)性β亞基組成。Nav1.5包含1個(gè)蛋氨酸殘基，其能被ROS所氧化，降低鈉通道開放度。ROS也會(huì)降低鈉通道的利用度，并延長(zhǎng)通道從失活狀態(tài)的恢復(fù)時(shí)間，引起鈉通道失活曲線負(fù)性偏移,但ROS并沒(méi)有改變鈉通道的激活特性。

最近一種新型的鈉通道電流（晚鈉電流）門控模式越來(lái)越受到關(guān)注，其也可由ROS來(lái)激活。峰鈉電流只持續(xù)極短時(shí)間（大約10 ms），但晚鈉電流可以持續(xù)數(shù)百毫秒。盡管晚鈉電流的幅度很?。s僅為峰電流的1％），由于其持續(xù)特性，仍可以使相當(dāng)?shù)拟c離子通過(guò)這種方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這表明在病理狀態(tài)下，晚鈉電流也是細(xì)胞內(nèi)鈉離子的重要調(diào)控者。研究顯示ROS可增加細(xì)胞內(nèi)鈉離子含量，延長(zhǎng)APD，導(dǎo)致早期復(fù)極（EADs），這些可能與ROS增強(qiáng)晚鈉電流有關(guān)[13]。

除了ROS直接氧化Nav1.5蛋白外，脂質(zhì)環(huán)境的改變或ROS誘導(dǎo)PKA、PKC和CaMKⅡ激活都可能與ROS對(duì)心臟鈉通道調(diào)控相關(guān)。Nav1.5 a亞基可被PKA、PKC及CaMKⅡ磷酸化。CaMKⅡ磷酸化位點(diǎn)在Ser571∕516及Thr594，由于磷酸化增強(qiáng)了鈉通道失活狀態(tài)，致使電壓依存性失活曲線負(fù)向偏移。雖然許多相關(guān)的磷酸化位點(diǎn)還不清楚，但已明確的是CaMKⅡ能夠增大晚鈉電流，使細(xì)胞內(nèi)鈉蓄積、APD延長(zhǎng)及心律失常發(fā)生。其潛在機(jī)制可能與上述ROS對(duì)鈉通道調(diào)控作用相關(guān)。而且，CaMKⅡ基因剔除小鼠中未觀察到ROS所引發(fā)的晚鈉電流改變，暗示CaMKⅡ可能在鈉通道氧化還原調(diào)控中的重要地位[14]。PKA及PKC均能夠影響心肌鈉通道。Nav1.5的Ⅰ～Ⅱ亞基連接環(huán)中有2個(gè)絲氨酸殘基（Ser526∕529）均可以被PKA磷酸化。PKA介導(dǎo)的Nav1.5磷酸化，可以加速通道移動(dòng)至細(xì)胞膜，進(jìn)而增強(qiáng)峰值鈉電流密度，但并不改變通道的失活動(dòng)力學(xué)。PKC也能調(diào)控鈉通道電流。在PKC被抑制前提下，H2O2減慢鈉通道失活的作用消失。在異源表達(dá)系統(tǒng)（大鼠及人Nav1.5），PKC的激活并沒(méi)有改變鈉通道的失活狀態(tài)，使人質(zhì)疑PKC在鈉通道調(diào)控中的作用。目前最統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)是，PKC可磷酸化心肌鈉通道Ⅲ～Ⅳ連接處的Ser1505，減小峰值鈉電流密度。盡管PKA和PKC都可以或多或少地影響鈉通道電流密度，這主要通過(guò)改變細(xì)胞膜上功能通道的數(shù)目，而不是對(duì)鈉通道門控屬性的調(diào)控（如激活及失活的過(guò)程）。因此，ROS引起PKA及PKC的激活并不能解釋ROS對(duì)鈉通道門控的調(diào)控，更可能的是線粒體產(chǎn)生的ROS（由細(xì)胞質(zhì)NADH衍生）通過(guò)PKC途徑降低峰值鈉電流密度。

3.2 NKA 生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)鈉離子很大程度受NKA調(diào)控。兔心室細(xì)胞暴露于H2O2后，即使出現(xiàn)ROS介導(dǎo)的鈉電流增強(qiáng)16倍，細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度也沒(méi)有明顯改變，這正是由于NKA極大地被激活[14]。盡管ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈉離子增加的具體機(jī)制還不清楚，但ROS本身就具有較強(qiáng)的NKA抑制能力。除了脂質(zhì)環(huán)境的改變外，也有可能是ROS對(duì)NKA的直接氧化作用。因?yàn)镹KA的β亞基含有一個(gè)巰基基團(tuán)，而這又是催化活性的必需基團(tuán)。

對(duì)NKA的氧化還原調(diào)控，除了直接氧化作用，也可通過(guò)PKA及PKC途徑。磷酸神經(jīng)膜（PLM）通過(guò)降低NKA與鈉的親和力，抑制NKA的活性。而PKA或PKC能磷酸化PLM，使其催化亞基分離而增強(qiáng)NKA作用。因?yàn)镽OS的實(shí)際作用是抑制NKA的活性，而ROS激活PKA及PKC會(huì)導(dǎo)致PLM磷酸化、解離，并增強(qiáng)NKA的功能，這一矛盾的推斷提示PKA和PKC不太可能參與ROS對(duì)NKA的調(diào)控[14]。如果NKA大量失活，將會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鈉激增。除了鈉通道引起鈉內(nèi)流增加，通過(guò)增強(qiáng)鈉-質(zhì)子交換機(jī)制加速鈉內(nèi)流也是有可能的，但具體的病理機(jī)制還未知。細(xì)胞內(nèi)的鈉與細(xì)胞內(nèi)的鈣緊密相關(guān)。心肌NCX的活性是膜電位及鈉鈣跨膜梯度的功能基礎(chǔ)。伴隨動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)的鈉增加，這樣通過(guò)NCX引起鈣外流減少（前向型模式），和（或）鈣內(nèi)流減少（逆向型模式），最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的聚集。事實(shí)上，在細(xì)胞內(nèi)的鈉增多狀況下，通過(guò)NCX的鈣內(nèi)流會(huì)更多[14]。

3.3 NCX 對(duì)心肌NCX而言，不同區(qū)域的半胱氨酸殘基間的二硫鍵可能是維持其功能的重要部分。ROS具有激活NCX的作用，但是其激活效果與ROS的量和來(lái)源并沒(méi)有表現(xiàn)出一致性。對(duì)于Ser∕Thr激酶在NCX調(diào)控中的作用有很多爭(zhēng)論。PKA及PKC的催化基團(tuán)并不能改變心肌NCX功能，暗示了NCX也許不受激酶的調(diào)控。另一方面，有報(bào)道表明，NCX的細(xì)胞內(nèi)環(huán)可以被PKA及PKC磷酸化，繼而增加NCX的活性，這也許是ROS增強(qiáng)NCX的部分原因[15]。在細(xì)胞內(nèi)鈉增加條件下，ROS對(duì)NCX刺激引起細(xì)胞內(nèi)鈣過(guò)載。事實(shí)上，在心衰中過(guò)表達(dá)的NCX增強(qiáng)了ROS介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。而抑制NCX的藥物，可以抑制鈣內(nèi)流，從而減少了ROS介導(dǎo)的鈣過(guò)載，消除細(xì)胞損傷[14]。

3.4 電壓門控L型鈣通道 心臟L型鈣通道的α1c亞基包含10個(gè)以上的半胱氨酸殘基，因此理論上能夠被氧化還原所調(diào)控。有報(bào)道表明，在異源表達(dá)系統(tǒng)（HEK293）或心肌細(xì)胞，巰基氧化劑或ROS能夠不可逆地減少鈣電流（ICa）。但另外一些報(bào)道表明，巰基氧化劑或ROS能夠增強(qiáng)ICa[16]。矛盾的原因可能是CaMKⅡ、PKA、PKC能夠通過(guò)磷酸化激活I(lǐng)Ca，而這3種激酶又由ROS介導(dǎo)氧化∕激活。PKA已經(jīng)被證明可以磷酸化L型鈣通道α1c亞基的一些位點(diǎn)，其中包括Ser1928[17]。然而鈣電流調(diào)控的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)仍然未知，因?yàn)閷?duì)α1c亞基及附屬的β亞基的磷酸化都能增強(qiáng)ICa。因此，ROS能夠通過(guò)激活絲氨酸激酶增大ICa，也能通過(guò)直接氧化作用減小ICa。這最終的效果依賴于ROS的來(lái)源及劑量。另外有報(bào)道證明H2O2所引發(fā)的鈣超載是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放和通過(guò)NCX流入所致，并非鈣通道激活[14]。ROS對(duì)α1c亞基最可能的作用是直接氧化還原調(diào)控。

3.5 RyR2 RyR由4個(gè)亞基組成，在心臟主要為RyR2型。每一亞基都含有89個(gè)半胱氨酸，其中有21個(gè)為游離態(tài)。巰基氧化物（如H2O2）在每個(gè)亞基上至少需氧化7個(gè)巰基后，才能激活RyR釋放鈣離子。因?yàn)镽yR2含有多個(gè)磷酸化調(diào)控位點(diǎn)，能與Ca2+、Mg2+、ATP、CaM或調(diào)節(jié)蛋白（FKBP12.6）相互作用，因此氧化作用可能與這些調(diào)節(jié)因子有關(guān)。事實(shí)上，ROS誘導(dǎo)RyR鈣釋放增加的機(jī)制包括RyR對(duì)胞漿Ca2+及ATP的敏感性改變，RyR與triadin（調(diào)控RyR對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+敏感性）的相互作用，干擾FKBP12.6的結(jié)合[18]。此外，低濃度ROS能夠增加舒張期RyR鈣釋放（鈣火花頻率），而過(guò)高濃度的ROS則抑制鈣火花頻率。因此ROS誘導(dǎo)的RyR的調(diào)控與具體的氧化程度有很大關(guān)聯(lián)。

ROS除了能直接氧化RyR半胱氨酸殘基，也能通過(guò)激活Ser∕Thr激酶來(lái)增加RyR鈣釋放。眾所周知，RyR2經(jīng)CaMKⅡ及PKA磷酸化后增加舒張期鈣滲漏。而這兩種激酶都可以通過(guò)ROS氧化激活。因此，ROS對(duì)RyR2的部分作用很有可能是通過(guò)氧化CaMKⅡ及PKA完成的。

舒張期鈣滲漏增加的一個(gè)后果就是減少了肌質(zhì)網(wǎng)（SR）鈣容量，尤其是在ROS降低SERCA功能的情況下[19]。已經(jīng)證明ROS可以減少SR鈣容量。這會(huì)導(dǎo)致暫時(shí)性鈣缺乏及降低收縮力[14,19]。由于前向型NCX的快速激活，舒張期鈣滲漏是延遲晚復(fù)極的主要因素。這種由ROS引發(fā)的鈣火花頻率的增加與晚復(fù)極的延遲及心律失常密切相關(guān)，尤其是在NCX已由ROS增強(qiáng)的狀況下[14]。

3.6 SERCA SERCA2a及其抑制型調(diào)控蛋白PLN都可以受氧化還原調(diào)控修飾。SERCA2a含有25個(gè)半胱氨酸殘基，其中只有1～2個(gè)殘基對(duì)酶活性具有關(guān)鍵作用。巰基氧化物或ROS可以抑制心肌SERCA2a活性，部分原因可能是直接影響其ATP結(jié)合位點(diǎn)[20]。此外，CaMKⅡ（Thr17）及PKA （Ser16）可以磷酸化PLN，使PLN解離，激活SERCA。后者可能與ROS依賴的SERCA調(diào)控沒(méi)有太大的關(guān)系，因?yàn)镽OS只顯示出抑制SERCA活性的功能，或許這與PKC介導(dǎo)的信號(hào)通路相關(guān)。與CaMKⅡ及PKA激活SERCA不同，PKC可降低SERCA的活性。心臟PKAα基因缺陷的小鼠表現(xiàn)為高收縮力，而PKAα基因過(guò)表達(dá)的小鼠表現(xiàn)為低收縮力，其內(nèi)在的機(jī)制可能與PKAα介導(dǎo)蛋白激酶抑制劑-1（PPI-1）磷酸化有關(guān)，PPI-1激活后使PLN脫磷酸化。SERCA2a活性的減少可以導(dǎo)致SR鈣容量的減少，并使鈣火花幅度降低或消失[21]。

4 ROS相關(guān)的心律失常

細(xì)胞內(nèi)鈉鈣處理蛋白的改變與心電不穩(wěn)定性密切相關(guān)。ROS延長(zhǎng)APD，引起EAD的機(jī)制，以前的研究認(rèn)為是ROS增大ICa。近年研究顯示選擇性鈉通道阻滯劑河豚毒素（TTX）可以逆轉(zhuǎn)ROS的這種延長(zhǎng)APD作用，主要是TTX抑制了ROS增強(qiáng)的晚鈉電流。最近進(jìn)一步證實(shí)，這種機(jī)制與氧化還原激活CaMKⅡ，增強(qiáng)晚鈉電流有關(guān)，晚鈉電流增加延長(zhǎng)APD，易引起EAD[14]。同時(shí)ROS介導(dǎo)的ICa增加和Ito電流減少在這種電不穩(wěn)定中也起著重要作用[22]。

ROS介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣超載和舒張期鈣滲漏能使NCX內(nèi)向電流增加，促使鈣離子向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，產(chǎn)生去極化電位，引起延遲后除極（DAD）。心肌暴露于ROS后，能顯著地增加EAD和DAD，這種作用在CaMKⅡ基因敲除的小鼠顯著減少[14]。因此，氧化還原對(duì)CaMKⅡ的調(diào)控在ROS介導(dǎo)的心律失常中起著重要的作用。

除ROS能致使鈉鈣處理蛋白調(diào)控障礙，ROS對(duì)線粒體ATP的影響也能增加心律失常的發(fā)生[23]。線粒體中ROS誘導(dǎo)ROS釋放，使線粒體去極化；同時(shí)抑制ATP合成，使胞質(zhì)KATP通道激活，導(dǎo)致APD縮短，延緩傳導(dǎo)。在心臟不同區(qū)域，線粒體膜除極時(shí)間和空間不一致，易產(chǎn)生折返和致死性心律失常。

5 結(jié)論

ROS增強(qiáng)晚鈉電流和減低NKA活性導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉積蓄和動(dòng)作電位延長(zhǎng)，促使ROS介導(dǎo)NCX的激活使鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。另一方面，ROS增強(qiáng)了RyR2開放率，同SERCA功能障礙（肌漿網(wǎng)鈣重吸收減低）一同引起舒張期鈣滲漏增加。肌質(zhì)網(wǎng)功能障礙并不能代償重吸收由NCX轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)鈣離子，這樣共同顯著提高了細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，減少了SR鈣火花頻率，致使心肌收縮性減低、心律失常發(fā)生和細(xì)胞損傷。

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（2014-05-01收稿 2014-06-10修回）

（本文編輯 閆娟）

Redox Regulation of Cardiac Na and Ca Handling Protein

LIU Yangong,LIU Gang,WANG Pu,ZHENG Mingqi△
Department of Cardiology,the 1stHospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050031,China△

E-mail:mzheng2020@163.com

Cardiac contractile dysfunction and arrhythmic genesis are resulted from disturbed intracellular Na+and Ca2+handling under condition of oxidation stress.Stress-induced intracellular signaling regulated mechanisms in which many activated stress kinases,such as cAMP-dependent protein kinase A,protein kinase C,Ca∕calmodulin-dependent protein kinaseⅡand classical pathways,are known to be involved.However,it is becoming increasingly evident that reactive oxygen species may directly oxidize these kinases,Na+and Ca2+channel protein and transporters,which lead to changing of intracellular Na+and Ca2+accumulation,and to trigger of arrhythmias.

oxidation stress;Na+and Ca2+handling;reactive oxygen species;redox system;arrhythmias

R331.8

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.024

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81100127）；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（2013M530120）；河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題項(xiàng)目(20130274)；河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（13277720D）

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)1科（郵編050031）

△通訊作者 E-mail：mzheng2020@163.com