周 潔，李玉銀，趙昌彩，刁愛坡

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

泛素連接酶Nedd4調(diào)控人前列腺癌細胞的增殖與凋亡

周 潔，李玉銀，趙昌彩，刁愛坡

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

為了研究泛素連接酶Nedd4對腫瘤細胞增殖和凋亡的影響，利用小RNA干擾技術，通過慢病毒包裝，侵染前列腺癌細胞DU145，達到下調(diào)Nedd4表達的目的．MTT檢測表明，下調(diào)Nedd4表達可以抑制DU145細胞的增殖；DAPI染色發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Nedd4表達的DU145細胞對星形孢菌素誘導的細胞凋亡更加敏感．這些結果都說明，下調(diào)Nedd4的表達不僅可以抑制DU145腫瘤細胞增殖，而且可以促進細胞凋亡．

Nedd4；前列腺癌細胞；細胞增殖；細胞凋亡

泛素連接酶和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉移密切相關[1]．在哺乳動物中，被鑒定的泛素連接酶有600多種．泛素連接酶主要分兩大類：RING家族和HECT家族．HECT家族由28種蛋白組成，基于結構的不同，HECT泛素連接酶家族成員多數(shù)分屬于兩個亞家族：Nedd4家族和HERC家族[2]．

Nedd4家族包括9個成員：Nedd4-1、Nedd4-2 (Nedd4L)、ITCH、Smurf1、Smurf2、WWP1、WWP2、NEDL1、NEDL2．這9個成員具有相似的結構，這些結構包括一個N端的C2結構域，中間有2～4個WW結構域，C端的與E6AP(E6 associated protein)[3]同源的COOH端[4]．Nedd4家族泛素連接酶在癌癥發(fā)生過程中起著重要作用．

在研究基因功能方面，RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術得到廣泛應用．RNAi是一種普遍的轉錄后基因沉默機制，由Fire等[5]于1998年發(fā)現(xiàn)．目前，主要通過兩條途徑來實現(xiàn)RNAi：第一，通過轉染短鏈干擾RNA(short interfering RNAs，siRNA)，實現(xiàn)目的基因沉默；第二，利用表達載體和逆轉錄病毒進行短鏈發(fā)夾RNA(short hairpin RNAs，shRNA)的轉錄，完成目的基因表達的降低[6-8]．

無論是轉染siRNA還是shRNA的轉錄，在體內(nèi)實驗和活體實驗中[9]，RNAi的作用都可能出現(xiàn)被抑制的現(xiàn)象．Rubinson等[10]利用shRNA慢病毒系統(tǒng)實現(xiàn)了在哺乳動物細胞、干細胞、受精卵及已分化的后代細胞中干擾目的基因表達．shRNA慢病毒系統(tǒng)進行的基因沉默具有高特異性、高穩(wěn)定性的優(yōu)點，并且能夠在多種細胞及轉基因小鼠中實現(xiàn)基因沉默．慢

病毒載體能夠快速有效地實現(xiàn)基因沉默，這為基因治療提供了一種新方法．

李季林等[11]通過瞬時轉染shRNA干擾Nedd4-1表達，證明Nedd4-1促進膠質瘤細胞的增殖并且影響細胞凋亡．本研究利用慢病毒載體，穩(wěn)定下調(diào)人前列腺癌細胞DU145中Nedd4的表達，構建穩(wěn)定細胞系，探討Nedd4對人前列腺癌細胞增殖及細胞凋亡的調(diào)控作用，試圖揭示Nedd4在前列腺癌中的功能，探索治療前列腺癌的新靶點．

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人前列腺癌細胞DU145、人胚腎上皮細胞系HEK293T，本實驗室保藏．Lipofectamine 2000轉染試劑，Invitrogen公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Penicilin and Streptomycin、L-Glutamic，Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)、DMSO，Solarbio公司；Nedd4抗體、β-actin單克隆抗體、干擾質粒載體pLKO.1-Nedd4 shRNA及陰性對照載體pLKO.1-scramble、MISSON Lentiviral Packaging Mix慢病毒包裝試劑盒，Sigma公司．

1.2 實驗方法

1.2.1 shRNA干擾載體慢病毒包裝及檢測

根據(jù)shRNA設計原則，在Sigma公司共購得5個Nedd4 shRNA目的序列，分別為：

①TRCN0000272424：CCGGCGGTTGGAGAATG TAGCAATACTCGAGTATTGCTACATTCTCCAA CCGTTTTTC；②TRCN0000272425：CCGGAGTGC TACTCGCAGCTATTTACTCGAGTAAATAGCTGCG AGTAGCACTTTTTTC；③TRCN0000272476：CCGG GCTGAACTATACGGTTCAAATCTCGAGATTTGAA CCGTATAGTTCAGCTTTTTC；④TRCN000027 2477：CCGGTACGTGAGAGTGACGTTATATCTCGA GATATAACGTCACTCTCACGTATTTTTC；⑤TRCN 0000284755：CCGGCCGGAGAATTATGGGTGTCAA CTCGAGTTGACACCCATAATTCTCCGGTTTTTC．

利用HEK293T細胞，參照Sigma公司MISSON Lentiviral Packaging Mix說明書進行慢病毒包裝，同時包裝陰性對照組scramble．收集慢病毒，侵染DU145細胞，Western blot檢測Nedd4蛋白表達情況．1.2.2 下調(diào)Nedd4表達的DU145穩(wěn)定細胞系的建立

DU145細胞接種于直徑為10,cm的培養(yǎng)皿，等細胞鋪展度達到60%～70%，用500,μL慢病毒收集液侵染細胞．陰性對照組用scramble慢病毒收集液侵染DU145細胞．24,h后更換含0.5,μg/mL嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基進行篩選．此后，待單克隆長至肉眼可見，挑起，轉移至新的平板繼續(xù)培養(yǎng)，然后收集細胞，檢測穩(wěn)轉細胞系是否建立成功．

1.2.3 免疫印跡檢測Nedd4蛋白表達

收集慢病毒侵染后及陰性對照組DU145細胞，離心棄上清液后，加入50,μL 強RIPA細胞裂解液，于冰浴中裂解20,min，然后于4,℃、13,000,r/min離心10,min．離心后棄沉淀，取蛋白進行SDS-PAGE電泳．電泳完畢，利用半干轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜上，用質量分數(shù)為5%的脫脂奶粉室溫封閉1,h，于4,℃下進行一抗孵育過夜．然后用體積分數(shù)為0.02%的Tween 20的PBS緩沖液(PBST)漂洗PVDF膜3～5次，每次5,min．洗完后于室溫下二抗避光孵育1,h．PBST漂洗3～5次，每次5,min．洗完后，用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)成像，以β-actin作對照．1.2.4 MTT檢測干擾Nedd4表達對DU145細胞增

殖的影響

實驗設置陰性對照組與Nedd4 shRNA實驗組，實驗組取干擾Nedd4表達的DU145穩(wěn)定細胞系，每組設3個復孔．96孔板每孔5×103個細胞，用MTT法分別于48、72、96,h用酶標儀測定波長570,nm處吸光度(A)以反映細胞增殖狀況．

1.2.5 DAPI染色檢測下調(diào)Nedd4表達對DU145細胞凋亡的影響

取干擾Nedd4表達的穩(wěn)定細胞系與陰性對照scramble細胞，接種細胞于蓋玻片上，用1.5,μmol/L星形孢菌素分別處理24、48,h；處理完畢后，取出蓋玻片，用PBS溶液洗2遍；用質量分數(shù)為4%的多聚甲醛固定5,min，再用PBS洗2次；用體積分數(shù)為0.2%的Triton,X-100處理10,min，處理完畢后用PBS洗2次，再用質量分數(shù)為3%的BSA封閉30,min；封閉完成后，用DAPI染細胞核，室溫閉光靜置30,min后，用PBS洗3次，最后用封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察．

2 結果與分析

2.1 shRNA干擾載體的慢病毒包裝及檢測

為了檢測不同序列shRNA下調(diào)Nedd4蛋白表達的效果，對shRNA干擾載體進行慢病毒包裝并侵染DU145細胞，免疫印跡檢測DU145細胞內(nèi)Nedd4蛋白表達，結果如圖1所示．

圖1中control為空白對照，不含慢病毒；scramble為陰性對照，是以含非靶基因shRNA的pLKO.1載體進行慢病毒包裝所得；2424、2425、2476、2477、4755為Nedd4靶基因shRNA的pLKO.1載體進行慢病毒包裝所得．如圖1所示，序列2425慢病毒收集液對細胞內(nèi)Nedd4蛋白表達干擾效果最好，序列2424和2477干擾效果次之，序列2476和4755干擾效果最差．所以選用序列2425慢病毒收集液進行后續(xù)實驗．

2.2 下調(diào)Nedd4表達的DU145穩(wěn)轉細胞系的建立

為了檢測下調(diào)Nedd4表達的DU145穩(wěn)轉細胞系是否構建成功，進行免疫印跡實驗，結果如圖2所示．與對照相比，用Nedd4 shRNA干擾載體慢病毒侵染的DU145穩(wěn)轉細胞系中Nedd4表達量降低，即干擾Nedd4表達的DU145穩(wěn)轉細胞系構建成功．

2.3 下調(diào)Nedd4表達對DU145細胞增殖的影響

利用MTT方法檢測下調(diào)Nedd4表達對DU145細胞增殖的影響，結果如圖3所示．

由圖3可知：各組細胞在接種后的96,h，下調(diào)Nedd4的DU145細胞數(shù)低于對照組(P＜0.01)，說明下調(diào)Nedd4表達可以抑制DU145細胞增殖．

2.4 下調(diào)Nedd4表達對DU145細胞凋亡的影響

凋亡細胞的細胞核皺縮、形狀不規(guī)則，熒光染色較正常細胞核濃，有些還會碎裂成塊狀．利用DAPI染色技術檢測下調(diào)Nedd4的表達對DU145細胞凋亡的影響，實驗結果如圖4所示．在接受星形孢菌素處理后，穩(wěn)定干擾Nedd4表達的DU145細胞核皺縮量明顯多于陰性對照組；且48,h后，穩(wěn)定干擾Nedd4表達的DU145細胞由于凋亡過多，視野中總細胞量減少．這些結果都說明下調(diào)Nedd4表達可以促進DU145細胞凋亡．

3 討 論

前列腺癌是在男性群體中比較常見的一種癌癥．研究[12]表明，Nedd4作為泛素連接酶家族中的一員，影響前列腺癌細胞的增殖與凋亡．

本研究采用的慢病毒載體系統(tǒng)是三質粒表達系統(tǒng)，分別為包裝質粒、包膜質粒和載體質粒．這個系統(tǒng)利用多質粒表達系統(tǒng)構建載體并且盡量減少質粒間重疊數(shù)量，這樣可以大大降低通過重組產(chǎn)生可復制性病毒的可能性，提高了慢病毒載體的安全性．

利用慢病毒載體系統(tǒng)包裝慢病毒，然后侵染DU145細胞，結果證實Nedd4的shRNA干擾序列TRCN0000272425成功下調(diào)了DU145細胞的Nedd4

蛋白表達，且利用該序列包裝的慢病毒收集液成功構建干擾Nedd4表達的穩(wěn)轉細胞系(圖1和圖2)．

原癌基因可以通過抑制細胞增殖或者促進細胞凋亡來影響腫瘤的生長．MTT實驗表明，干擾Nedd4表達后，DU145細胞的增殖能力較對照組降低，說明Nedd4能夠促進前列腺癌細胞的增殖(圖3)．DAPI染色結果顯示，下調(diào)Nedd4表達后，前列腺癌細胞對星形孢菌素誘導的細胞凋亡的敏感性明顯增強，說明下調(diào)Nedd4能夠促進細胞凋亡(圖4)．

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著重要作用，其中Caspase-3作為關鍵的執(zhí)行分子，在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能．Nedd4影響細胞凋亡的過程中，是否發(fā)生了Caspase-3酶原的激活及剪切，還有待進一步研究．

PTEN作為抑癌基因，在細胞的生長、分化、死亡方面起著重要作用[13-14]．在多種人類細胞和組織中，PTEN的突變或敲除促進腫瘤發(fā)生[15]．PTEN負調(diào)控PI3K/Akt信號通路[16]，能夠被泛素介導的蛋白酶體降解，在老鼠的模型及多種人類癌癥樣本中，PTEN的表達水平均明顯低于正常細胞表達量，與此同時，Nedd4-1高表達[17-18]，表明Nedd4-1對PTEN具有負調(diào)控作用．

相反，也有研究[19]表明敲除Nedd4-1后，并不影響PTEN的降解與它的亞細胞定位．Eide等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Nedd4在結腸癌細胞中高表達，并且促進癌細胞增殖，但是并不依賴PI3K/PTEN/Akt信號通路，PTEN表達量與Nedd4沒有直接關系．這對于進一步證實Nedd4是否作為PTEN的負調(diào)控因子并且影響PTEN降解與核轉移是一個挑戰(zhàn)．

Nedd4參與生長因子受體的調(diào)控，包括胰島素生長因子受體-1(IGF-1,R)、血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGF-R2)、上皮生長因子受體(EGFR)等[22-23]. Nedd4敲除后的轉基因小鼠的主要表現(xiàn)為生長阻滯，同時小鼠胚胎成纖維母細胞(MEFs)在敲除Nedd4后生長緩慢，并且在血清饑餓處理后，相對于野生型細胞，敲除Nedd4的MEFs反應異常[24]．

Nedd4蛋白家族擁有9個成員，9個成員分別有各自的功能，例如：除Nedd4-1、Nedd4-2以外，Smurf1調(diào)控腫瘤細胞運動性、BMP/Smad1通路等；Smurf2通過Smad2和TGF-β 受體抑制TGF-β 信號通路，從而介導完成泛素化降解[25–26]；ITCH作為細胞命運調(diào)節(jié)因子Notch，調(diào)控細胞活動；WWP1參與p53的定位與轉錄；WWP2是上皮鈉離子通道；NEDL1是超氧化物歧化酶1的突變體；NEDL2負責穩(wěn)定p73及其轉錄調(diào)控等[27]．這9個家族成員在各自主要功能以外是否存在相互之間的功能補充還需要大量的研究來尋求答案．

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責任編輯：周建軍

Effects of Ubiquitin Ligase Nedd4 on Human Prostate Cancer Cell Proliferation and Apoptosis

ZHOU Jie，LI Yuyin，ZHAO Changcai，DIAO Aipo
(College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

To study the effects of Nedd4 on tumor cell proliferation and apoptosis，Nedd4 was depleted in prostate cancer cell DU145 by infecting the lentiviruses expression of Nedd4-shRNAs. MTT assay showed that that depletion of Nedd4 decreased DU145 cell proliferation. DAPI staining indicated that knockdown of Nedd4 resulted in greater sensitivity to staurosporine-induced apoptosis of DU145 cells. These results revealed that the down-regulation of Nedd4 expression not only reduced the cell proliferation but also induced the apoptosis of DU145 cells.

Nedd4；prostate cancer cell；cell proliferation；cell apoptosis

R737.25

A

1672-6510(2014)05-0015-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.004

2013–12–18；

2014–03–31

天津市自然科學基金重點資助項目(10JCZDJC16800)；國家自然科學基金資助項目(31071181)

周 潔（1987—），女，江蘇徐州人，碩士研究生；通信作者：刁愛坡，教授，diaoaipo@tust.edu.cn.