劉 偉，郭振飛，燕志慧，盧美琪，楊 誠

(1. 天津科技大學理學院，天津 300457；2. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；3. 天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457)

新型Caspase-3抑制劑1，2–苯并異噻唑–3–酮–1，4–二取代–1，2，3–三唑類衍生物的合成

劉 偉1，郭振飛2，燕志慧2，盧美琪3，楊 誠3

(1. 天津科技大學理學院，天津 300457；2. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；3. 天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457)

為探究對Caspase-3有更高抑制活性的非肽類小分子抑制劑，用“點擊反應”合成了一系列1，2–苯并異噻唑–3–酮–1，4–二取代–1，2，3–三唑類衍生物．通過體外Caspase-3和Caspase-7抑制活性測試發(fā)現(xiàn)，化合物7c對Caspase-3有最好的抑制活性，IC50達到11.0±1.2,nmol/L．為了更好的理解這些化合物與Caspase-3蛋白的相互作用模式，進行了分子對接實驗．結(jié)果表明，化合物7c與蛋白作用位點具有很好的結(jié)合模式，驗證了該化合物具有很好的體外Caspase-3抑制活性．

抑制劑；1，2–苯并異噻唑–3–酮；分子對接；點擊反應；Caspase-3

凋亡或程序性細胞死亡是細胞組織發(fā)展和保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要生理過程．正常的細胞凋亡是機體必須的代謝過程，但是細胞的非正常凋亡往往會引發(fā)各種各樣的病癥，例如：神經(jīng)退行性疾病，缺血性損傷，自身免疫性疾病及癌癥[1]．Caspase家族參與細胞凋亡的整個過程，已發(fā)現(xiàn)的15種Caspase蛋白可以分為3類：Caspase-1、-4、-5、-11參與白介素前體活化，與細胞炎癥有關(guān)；Caspase-2、-8、-9、-10等是凋亡上游調(diào)節(jié)子，是凋亡起始者；Caspase-3、-6、-7是凋亡的執(zhí)行者[2]．其中，Caspase-3在細胞凋亡中起著關(guān)鍵的作用．許多疾病都與Caspase-3的異常激活有關(guān)，因此，Caspase-3蛋白被認為是1個有藥物開發(fā)前景的靶點，Caspase-3抑制劑的研究也成為了熱點．

依據(jù)Caspase-3蛋白底物的特異性，目前已設(shè)計并合成了大量肽類和非肽類抑制劑．大部分肽類抑制劑對Caspase-3有很高的抑制活性，IC50一般在納

摩爾級別[3–5]，但是肽類抑制劑代謝穩(wěn)定性差、細胞滲透性差等因素限制了其應用．這就促使了對非肽類抑制劑的研究．例如：以5–硝基靛紅為母核合成了一系列的衍生物，個別衍生物對Caspase-3的IC50在納摩爾級別[6–7]．喹啉酮和異喹啉酮類化合物也被證實對Caspase-3有很好的抑制活性，IC50在微摩爾至毫摩爾范圍[8]．最近，本研究組[9]通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)了1個對Caspase-3有抑制活性的母核，1，2–苯并異噻唑–3–酮(IC50＝46.7,μmol/L)．經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾，發(fā)現(xiàn)其衍生物對Caspase-3有很好的抑制活性，IC50達到31,nmol/L，但是該系列化合物水溶性差，仍需繼續(xù)進行結(jié)構(gòu)改造．

近年來，三唑合成因“點擊反應”的特異性、高產(chǎn)率等特點在藥物化學中倍受青睞[10]．此外，在分子中引入1，2，3–三唑基團有如下好處：(1)1，2，3–三唑是肽鍵的生物等排體；(2)1，2，3–三唑代謝穩(wěn)定，并能形成氫鍵，從而提高水溶性，有利于藥物與其目標的結(jié)合；(3)1，2，3–三唑可連接2個藥效團，得到1種創(chuàng)新雙官能團藥物，這在構(gòu)建生物活性分子和功能分子中起到了越來越重要的作用；(4)1，2，3–三唑及其衍生物是非常重要的藥物化學模型，具有生物活性多樣性，如抗結(jié)核、抗HIV和抗菌等．此外，在已報道的Caspase-3抑制劑文獻中，1，2，3–三唑也被引入活性分子中，用于結(jié)構(gòu)改造．例如：在2008年，Ng等[11]報道了1，2，3–三唑類衍生物作為Caspase-3抑制劑，其活性都在微摩爾級別．最近，Robert等[7]報道了靛紅1，4–二取代的1，2，3–三唑類化合物作為Caspase-3抑制劑，發(fā)現(xiàn)抑制活性最好的衍生物的IC50達到了4.5,nmol/L．因此，本文將1，2，3–三唑環(huán)引入1，2–苯并異噻唑–3–酮類Caspase-3抑制劑結(jié)構(gòu)中，希望可以進一步提高該類化合物對Caspase-3的體外抑制活性，還同時評估了其對同族蛋白Caspase-7的體外抑制活性．

1 材料與方法

1.1 主要原料

1，2–苯并異噻唑–3–酮、抗壞血酸鈉、三光氣、丙炔氨、各種取代苯胺等，分析純，購自北京百靈威科技有限公司．

用于分別檢測化合物對Caspase-3和Caspase-7體外抑制活性的四肽熒光底物Ac-LDEVD-AMC和 Ac-DEVD-AMC，購自上海吉爾生化有限公司．

甲醇、三乙胺、二氯甲烷及四氫呋喃等溶劑，分析純，購自北京化學試劑公司，使用前均經(jīng)重蒸除水.

1.2 儀器

循環(huán)水式真空泵，河南省予華儀器有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)；低溫恒溫反應浴，鞏義市京華儀器有限公司；Avance DPX–400,MHz核磁共振儀，瑞士Bruker公司；傅里葉變換紅外光譜儀，珀金埃爾默儀器有限公司．

1.3 實驗方法

1.3.1 目標化合物的合成方法

取代苯胺(4,mmol)、0.552,g(8,mmol)亞硝酸鈉溶于15,mL水中，冷卻至0,℃，并滴加15,mL (12,mmol)HCl溶液，攪拌30,min即得化合物2溶液；向上述溶液中滴加15,mL疊氮化鈉(0.312,g，4.8,mmol)水溶液，反應4,h后用二氯甲烷萃取，收集有機層，并旋除二氯甲烷，得到有機疊氮產(chǎn)物3[12]．

將溶于40,mL二氯甲烷的1.28,g(40,mmol)丙炔氨逐滴加入溶于40,mL二氯甲烷的三光氣溶液中，并滴加6,mL三乙胺，反應12,h后旋除溶劑；將殘余物溶于40,mL二氯甲烷中，并滴入溶有3.02,g (20,mmol)1，2–苯并異噻唑–3–酮的20,mL四氫呋喃溶液中，反應12,h后旋除溶劑；將固體溶于30,mL丙酮與30,mL水的混合溶劑中，抽濾，所得固體為末端炔化合物6．

將0.650,g(2.8,mmol)末端炔、4,mmol有機疊氮溶于30,mL甲醇中，并加入催化劑CuSO4(0.032,g，0.2,mmol)和抗壞血酸鈉(0.08,g，0.4,mmol)．室溫反應12,h，旋除溶劑，硅膠柱層析分離得目標1，2，3–三唑類化合物(7a—7n)．目標化合物的合成路線如圖1所示．

1.3.2 Caspase-3蛋白及Caspase-7蛋白的體外酶活測定

Caspase-3抑制劑的檢測方法參考文獻[9]．本實驗中的Assay buffer：0.1% CHAPS，50,mmol/L HEPES(pH 7.5)，100,mmol/L NaCl，10% glycerol，1,mmol/L EDTA；底物：Ac–LDEVD–AMC．詳細操作如下：在室溫的條件下，在96孔板中放入人重組Caspase-3蛋白，并孵育10,min，加入2,μL溶于DMSO的一定濃度的抑制劑，然后加入2,μL底物Ac–LDEVD–AMC，收集熒光值10,min，依據(jù)所收集的熒光數(shù)據(jù)計算出該化合物的15個濃度梯度的剩余活性，然后用GraphPad Prism 5作圖分析，橫坐標為化合物濃度的常用對數(shù)值，縱坐標為剩余活性．然后計算出各個化合物的IC50．

人重組Caspase-7酶活測定實驗條件與上述Caspase-3的類似，只是底物改為Ac–DEVD–AMC．1.3.3 化合物7c與Caspase-3蛋白的分子對接

為了探究抑制劑與Caspase-3蛋白活性位點間的相互作用以及結(jié)合模式，將抑制Caspase-3活性最好的化合物7c在Schr?dinger Suite 2010軟件中采用格萊德標準進行分子對接．從PDB蛋白質(zhì)網(wǎng)站選取與Caspase-3蛋白共晶的小分子化合物(PDB ID code 3,H0E)作為參照．并且，按以下方式處理蛋白：去掉所有的硫酸根離子、水分子；優(yōu)化氫鍵網(wǎng)絡(luò)；用LigPrep2.4處理配體，用OPLS2005力場處理配體的局部電荷，并產(chǎn)生蛋白初始的3,D結(jié)構(gòu)；以配體為中心，建立1個“盒子”，大小為1.2,nm．

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物7c的表征結(jié)果

抑制活性最好的化合物7c的核磁圖譜如圖2所示．化合物7c的結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)如下：收率0.72,g，70%；白色固體；熔點209.2～209.8,℃；1H NMR (400,MHz，DMSO)δ 9.36(t，J＝6.0,Hz，1,H)，8.74(s，1,H)，8.03(d，J＝8.4,Hz，1,H)，7.97～7.93(m，3,H)，7.80(t，J＝7.6,Hz，1,H)，7.52～7.42(m，3,H)，4.71(d，J＝6.0,Hz，2,H)；13,C NMR(100,MHz，DMSO)δ 164.9，162.1(d，J＝244,Hz)，151.3，145.9，141.3，134.5，133.7(d，J＝3,Hz)，127.0，126.5，125.1，122.8(d，J＝8,Hz)，122.6，121.93，117.2(d，J＝23,Hz)，36.1；IR：3,295，1,699，1,665，1,516；ESIMS：369.99(M＋H)+．

其他目標化合物的表征圖譜和表征數(shù)據(jù)略．

2.2 生物活性測試

以先前合成的1，2–苯并異噻唑–3–酮衍生物[9]作為陽性對照，對一系列1，4–二取代–1，2，3–三唑類衍生物進行了活性評估，其IC50值見表1．

由表1可以看出：大部分化合物對Caspase-3和Caspase-7的抑制活性都在納摩爾級別；在所合成的目標化合物中，7c對Caspase-3和Caspase-7都有很好的抑制活性，IC50分別是11.0±1.2,nmol/L和5.2± 0.4,nmol/L，7,m對Caspase-3和Caspase-7有最低的抑制活性，IC50分別是6,830±560,nmol/L和16,730 ±2.7,nmol/L；有趣的現(xiàn)象是目標化合物對Caspase-7的抑制活性普遍比Caspase-3的高，例如：7b和7c對Caspase-3的抑制活性分別為IC50＝15.0±0.9,nmol/L和11.0±1.2,nmol/L，而7b和7c對Caspase-7的抑制活性分別為IC50＝7.1±0.5,nmol/L和5.2± 0.4,nmol/L，Chu等[7]在2011年也報道了類似結(jié)果；化合物7,j對Caspase-3的抑制活性大約是化合物7,i對Caspase-3的抑制活性的5倍，而對于Caspase-7的抑制活性，化合物7,j大約為化合物7,i的8倍；引入1，2，3–三唑基團后，化合物7,c對Caspase-3的抑制活性是陽性對照的3倍左右．

2.3 分子對接

為了闡明1，2，3–三唑化合物的生物活性，以便引導今后的結(jié)構(gòu)改造，將化合物7c與Caspase-3蛋白進行了分子對接．為方便比較，將共晶抑制劑和陽性對照也與Caspase-3蛋白進行了對接，如圖3所示．

由圖3(a)可知：Caspase-3的活性位點包括S1、S2、S3、S4共4個口袋．共晶抑制劑小分子很好地填充在了4個口袋里面，在S1口袋里面，共晶抑制劑的嘧啶與主鏈上H121的羰基形成了氫鍵，共晶抑制劑的羰基和磺?；c主鏈上C163和R207上的NH分別形成了2個氫鍵；另外，共晶抑制劑的吡咯環(huán)和苯氧環(huán)在S3、S4口袋里面也有疏水作用．

由圖3(b)可知：與共晶抑制劑結(jié)合模式相似，化合物7c很好地填充在S1、S2、S3口袋里面，脲結(jié)構(gòu)上的羰基和NH與R207和T62在S2口袋里面形成了3個氫鍵；7c的苯并異噻唑上的苯環(huán)深深地插入了疏水的S3口袋，形成了很強的疏水作用；而且，7c的對氟基苯環(huán)與F128殘基有π-π共軛．綜上所述，7c與Caspase-3有很好的結(jié)合，驗證了它對Caspase-3蛋白有非常好的體外抑制活性．

由圖3(c)可知：與化合物7c的對接模型相似，陽性對照也是很好地填充在S1、S2、S3口袋里面，脲結(jié)構(gòu)上的羰基和NH與R207和H121形成了3個氫鍵．但是，它的乙基苯環(huán)僅與Y204、W214上面的2個苯環(huán)形成弱的疏水作用．因此，化合物7c的活性是陽性對照的3倍左右．

3 結(jié) 語

本文合成了一系列結(jié)構(gòu)新穎的1，4–二取代的

1，2，3–三唑類化合物，并對其進行了分子水平的活性評價．首先，探究了它們對Caspase-3和Caspase-7的體外酶活活性，結(jié)果表明目標化合物對Caspase-3和Caspase-7的活性普遍達到納摩爾級．其次，分子對接實驗表明，化合物7c與Caspase-3蛋白可以形成多個氫鍵，并有很強的疏水和π-π堆積作用，良好的結(jié)合效果佐證了其具有很好的體外抑制活性．這些實驗結(jié)果為Caspase-3抑制劑的結(jié)構(gòu)改造提供了方向．

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責任編輯：常濤

Synthesis of 1，2-benzisothiazol-3-one-derived 1，2，3-triazoles as a Novel Class of Caspase-3 Inhibitors

LIU Wei1，GUO Zhenfei2，YAN Zhihui2，LU Meiqi3，YANG Cheng3
(1. College of Science，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；
2. College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；
3. Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，Tianjin 300457，China)

In order to get a non-peptide inhibitor with higher inhibitory activities against caspase-3，a series of 1，2-benzisothiazol-3-one-derived 1，4-disubstituted 1，2，3-triazoles was prepared using the “click reaction” and evaluated as inhibitors against caspase-3，-7. The most potent caspase-3 inhibitor was found to be 7c with IC50-values of 11.0± 1.2,nmol/L. Moreover，in order to better rationalize the action and the binding mode of these compounds，docking studies were carried out. The result suggests that there is good binding mode between 7c and caspase-3,protein.

inhibitor；1，2-benzisothiazol-3-one；docking；click reaction；caspase-3

R914.2

A

1672-6510(2014)05-0010-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.003

2014-03-04；

2014-05-21

國家自然科學基金青年基金資助項目(21302139)

劉 偉（1978—），男，天津人，副教授，liuwei2006@tust.edu.cn.