張 健，劉國新，張 穎，劉 浩

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；

2. 食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

尿素醇解反應(yīng)的影響因素及動力學(xué)研究

張 健1，劉國新1，張 穎2，劉 浩1

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；

2. 食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

針對尿素和乙醇反應(yīng)體系，采用Box-Behnken設(shè)計研究反應(yīng)溫度、體系pH和乙醇體積分?jǐn)?shù)對氨基甲酸乙酯生成的影響，并根據(jù)反應(yīng)機理，建立了尿素和乙醇親核取代反應(yīng)生成氨基甲酸乙酯的表觀動力學(xué)方程．結(jié)果表明，高溫、高乙醇體積分?jǐn)?shù)和較小的pH有利于氨基甲酸乙酯的生成．通過建立的模型可以很好地預(yù)測尿素–乙醇–水三元體系中氨基甲酸乙酯的生成量，但在真實酒樣中，該模型對氨基甲酸乙酯含量的預(yù)測值為實測值的66.4%～86.5%，從動力學(xué)的角度證明干紅葡萄酒中尿素為氨基甲酸乙酯的主要前體，但并非唯一前體．

尿素；乙醇；氨基甲酸乙酯；動力學(xué)

尿素又稱碳酰二胺、碳酰胺、脲，廣泛存在于發(fā)酵食品中．除了原料引入和人為添加外，釀酒酵母的氮代謝亦是發(fā)酵食品中尿素的主要來源[1]．已有大量研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，尿素和乙醇在自然條件下可反應(yīng)生成氨基甲酸乙酯(EC)，而EC是國際癌癥研究機構(gòu)認(rèn)定的2A類致癌物，受到聯(lián)合國糧農(nóng)組織的重點監(jiān)控[5]. 雖然EC的前體物質(zhì)很多，但尿素被認(rèn)為是EC的主要前體[6]，從某種意義來說，尿素的含量可以反映發(fā)酵食品中潛在的EC含量．

關(guān)于尿素和乙醇的反應(yīng)過程，國內(nèi)外報道的不多. 1988年，Ough等[7]曾對比多種的氨甲?；衔?包括尿素)與乙醇生成EC的反應(yīng)過程，發(fā)現(xiàn)酸性條件和高溫環(huán)境有利于該類反應(yīng)的進行．此后，又有學(xué)者[8]研究了不同貯藏時間和溫度對葡萄酒中EC生成的影響，其重點也是監(jiān)測尿素和乙醇的反應(yīng)．現(xiàn)已知尿素和乙醇生成EC的反應(yīng)過程受體系pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度和時間等因素的影響，但已有的報道缺乏對這些影響因素的深入研究以及對該反應(yīng)的

動力學(xué)描述．為此，本文將深入研究不同因素對該反應(yīng)體系的影響，從動力學(xué)的層面對反應(yīng)進行合理地解釋，建立相應(yīng)的動力學(xué)方程，并嘗試將該動力學(xué)方程應(yīng)用于實際葡萄酒樣品的EC含量預(yù)測中．

1 材料與方法

1.1 原料及試劑

干紅葡萄酒，市售；尿素、無水乙酸、酒石酸，分析純；乙酸鈉、濃鹽酸，化學(xué)純；氨基甲酸乙酯(純度大于99%)、9-羥基噸(純度大于99%)，Sigma公司；無水乙醇、乙腈，色譜純；娃哈哈純凈水．

1.2 實驗方法

1.2.1 影響因素實驗

本研究采用Box-Behnken設(shè)計[9]研究尿素和乙醇的親核取代反應(yīng)，系統(tǒng)研究溫度、pH和乙醇體積分?jǐn)?shù)對氨基甲酸乙酯生成的影響．實驗因子水平的選取見表1．體系pH調(diào)節(jié)采用酒石酸，尿素質(zhì)量濃度固定為500,mg/L，反應(yīng)時間為6,d．

1.2.2 動力學(xué)研究

在體積分?jǐn)?shù)為11.5%的乙醇水溶液中加入一定量尿素，至尿素質(zhì)量濃度為50,mg/L，采用1,mol/L的酒石酸溶液調(diào)節(jié)體系pH為3.5，此即為簡單的紅酒模擬體系．將該體系樣品分別置于283、303、343,K的溫度條件下保存0、10、20、30、40、50、60,d，取樣測定尿素和氨基甲酸乙酯質(zhì)量濃度，擬合相應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)．

隨機選取3種市售紅酒，分別測定初始尿素和EC的質(zhì)量濃度，然后將3種紅酒置于343,K的溫度條件下密封保存20、40、60,d，測定EC的質(zhì)量濃度，驗證動力學(xué)方程．

1.3 分析方法

采用HPLC-FLD法[10]測定尿素和EC質(zhì)量濃度．取600,μL樣品和400,μL 9–羥基噸溶液，加入100,μL 1.5,mol/L稀鹽酸后振蕩搖勻，在30,℃避光條件反應(yīng)30,min，反應(yīng)后的樣品經(jīng)0.22,μm的有機膜過濾后進行色譜分析．

1.4 模型參數(shù)擬合方法

采用Origin Pro 8.1進行曲線擬合，模型參數(shù)的求解由最小二乘法擬合實驗數(shù)據(jù)得到．

2 結(jié)果與討論

2.1 不同條件對反應(yīng)過程的影響

不同的反應(yīng)條件，如pH、反應(yīng)溫度、體系基質(zhì)等都會對特定的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生影響．對于尿素和乙醇的親核取代反應(yīng)，亦有一些相關(guān)的報道探討各因素的作用；但已有的研究多為單因素實驗，對于不同因素的交互作用探討的不多．因此，本研究采用Box-Behnken設(shè)計，試圖用較少的實驗得到較多的信息，尤其是單因素實驗無法探究的各因素之間的交互作用信息．實驗結(jié)果見表2．

對表2中實驗數(shù)據(jù)進行多項式回歸分析，擬合所得二次方程為Y＝10,798.86＋7,750,X1－1,109.11,X2＋213.06,X3＋5,376,X12＋335.05,X1,X2＋305.84,X1,X3＋551.26,X22＋257.73,X2,X3＋219.64,X32，回歸方程的方差分析見表3．由表3可知：該模型極顯著(P＜0.01)，而且經(jīng)分析計算該模型的確定系數(shù)2R＝0.997,9，表明模型擬合很好．溫度、pH對EC質(zhì)量濃度的線性效應(yīng)顯著；且溫度對EC質(zhì)量濃度的曲面效應(yīng)也顯著；乙醇體積分?jǐn)?shù)以及各因素的交互影響不顯著．溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對EC的生成影響都是正效應(yīng)，即溫度的升高或乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大有利于EC的生成；而pH的影響是負(fù)效應(yīng)，較小的pH有利于EC的生成，這與Stevens等[4]的報道一致．

2.2 動力學(xué)方程的建立

尿素和乙醇的反應(yīng)可以用式(1)[11]來表示.

根據(jù)式(1)可知，1,mol的尿素與1,mol的乙醇反應(yīng)生成1,mol的氨基甲酸乙酯，假若反應(yīng)完全進行且反應(yīng)過程中沒有物料損失，可以根據(jù)尿素的消耗速率來推算EC的生成速率．然而，實際情況并非如此，尿素在本反應(yīng)體系中還會發(fā)生水解反應(yīng)，而在酒類飲料中可能發(fā)生的反應(yīng)更為復(fù)雜．如果反應(yīng)體系中的尿素是EC的唯一前體，則體系中EC的含量可以用式(2)表示.

式中：1k為由尿素生成EC的反應(yīng)速率常數(shù)，d-1；ECρ為EC質(zhì)量濃度，μg/L；ureaρ為尿素質(zhì)量濃度，μg/L；t為反應(yīng)時間，d．

假設(shè)尿素分解的反應(yīng)級數(shù)為1級，則urealnρ應(yīng)與時間t成線性相關(guān)．分別以283、303、343,K的實驗數(shù)據(jù)進行擬合，用最小二乘法進行線性回歸，其線性復(fù)相關(guān)系數(shù)分別為0.947,4、0.931,7、0.947,5．由此可知，反應(yīng)級數(shù)為1的假設(shè)是成立的，故以下均以1級為準(zhǔn)確定尿素分解反應(yīng)的動力學(xué)方程及活化能．典型的1級動力學(xué)方程可用式(3)表示．

式中：2k為尿素分解反應(yīng)速率常數(shù)，d-1．

式(3)積分得

將式(4)代入式(2)得到EC生成的動力學(xué)方程．

根據(jù)不同時間實測的尿素質(zhì)量濃度擬合方程(式(3))可以求出2k，將2k代入式(5)，再根據(jù)不同時間實測的EC質(zhì)量濃度可以擬合求得1k，結(jié)果見表4.

由表4可知：在所選的溫度條件下，該模型與實驗數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)(2R)均在0.93以上，證明本文所提出的動力學(xué)模型與實驗值吻合良好，能夠用來預(yù)測EC隨時間的變化規(guī)律．為了預(yù)測任意溫度下EC隨時間的變化規(guī)律，引入了Arrhenius方程．

式中：k為反應(yīng)速率常數(shù)；0k為指前因子；aE為表觀活化能；R為通用氣體常數(shù)．

對Arrhenius方程兩邊取對數(shù)，可得

以lnk為縱坐標(biāo)，1/T為橫坐標(biāo)作圖，回歸后可得到lnk與1/T的關(guān)系式．對于k1，關(guān)系式為lnk1= 12.05?4 656.9/T ；對于k2，關(guān)系式為lnk2=7.55?4 382.9/T．由此可得，尿素生成EC反應(yīng)的表觀活化能Ea=38.7,kJ/mol，指前因子k0為2.683×105,mL/ (mol·d)；尿素分解反應(yīng)的表觀活化能Ea=36.4,kJ/ mol，指前因子k0為1.9×103,mL/(mol·d)．

根據(jù)Arrhenius方程，可以求出任意溫度條件下的k1和k2，因此只要知道尿素和EC的初始質(zhì)量濃度，就可以根據(jù)式(5)預(yù)測不同時間內(nèi)EC的質(zhì)量濃度．為了驗證方程的預(yù)測能力，按照1.2.2中的方法

處理3種酒樣后，比較EC質(zhì)量濃度的預(yù)測值和實測值，結(jié)果見表5．

結(jié)果表明：EC預(yù)測結(jié)果普遍偏低13.5%～33.6%，即預(yù)測值為實測值的66.4%～86.5%．本研究中動力學(xué)方程是基于尿素和乙醇的醇解反應(yīng)，并且假設(shè)尿素為EC的唯一前體而建立的．事實上，除尿素外，有報道[11]認(rèn)為瓜氨酸和氨甲酰磷酸等物質(zhì)都是EC的潛在前體，只是此類物質(zhì)對EC形成的貢獻很?。緦嶒炈镁茦又泻芸赡艽嬖诔蛩赝獾钠渌鸈C前體，也許這就是導(dǎo)致該方程應(yīng)用于實際酒樣中預(yù)測結(jié)果偏低的原因．另外，本研究是基于模擬體系(乙醇體積分?jǐn)?shù)為11.5%，pH 3.5)的動力學(xué)建模，而實際紅酒樣品中的乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH并不固定，一般乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%～13%，而pH為3.2～3.6．因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH的不確定性也可能會對方程EC含量的預(yù)測形成干擾，包含這些干擾因素的更為復(fù)雜的動力學(xué)模型還有待進一步研究．

3 結(jié) 論

尿素和乙醇的親核取代反應(yīng)，在高溫、低pH和高乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下更易進行，會生成較多的EC，但各因素間的交互影響作用并不明顯．在283～343,K的溫度范圍內(nèi)，尿素和乙醇親核取代反應(yīng)的表觀活化能為38.7,kJ/mol，而尿素分解反應(yīng)的表觀活化能為36.4,kJ/mol．通過建立的模型可以很好地預(yù)測尿素–乙醇–水三元體系中EC的生成量；但在真實酒樣中，該模型對EC含量的預(yù)測值為實測值的66.4%～86.5%．本研究從動力學(xué)的角度證明干紅葡萄酒中尿素為EC的主要前體，但并非唯一前體．

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責(zé)任編輯：周建軍

Influencing Factors and Kinetics of Urea Alcoholysis Reaction

ZHANG Jian1，LIU Guoxin1，ZHANG Ying2，LIU Hao1
(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；
2. Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

The effect of temperature，pH，and ethanol on urea alcoholysis reaction was studied using Box-Behnken experimental design. An apparent kinetics model of the urea reaction with ethanol to form ethyl carbamate was developed based on the reaction mechanism. Results indicate that the high temperature，high ethanol content and low pH value are conducive to the formation of ethyl carbamate. The predicted value of the ethyl carbamate fits well with the measured values in ureaethanol-water system，but fits poorly in the real wine samples. In fact，the predicted values are only 66.4% to 86.5%of the measured values. It suggests that the urea is the main precursor of ethyl carbamate，but not the only one in red wine，from the view of kinetics.

urea；ethanol；ethyl carbamate；kinetics

O643.1

A

1672-6510(2014)05-0006-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.002

2013–12–20；

2014–03–25

國家自然科學(xué)基金資助項目(31101275，31201354)

張 ?。?978—），男，甘肅蘭州人，副研究員；通信作者：劉 浩，教授，liuhaokd@tom.com.