馬 冬，楊艷艷，趙 力，金玉蘭，王 洋，李 鷗

宮頸癌患者機(jī)體內(nèi)免疫微環(huán)境的變化已受到人們重視[1]，其中輔助性T細(xì)胞(T helper，Th)亞群Th1/Th2的變化在惡性腫瘤免疫逃逸中十分重要[2]。組織特異性DNA甲基化譜是基因組的一個(gè)顯著特征，近年來(lái)研究表明，基因甲基化異常與宮頸癌變有關(guān)[3]，因此制定宮頸癌Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子DNA甲基化譜對(duì)宮頸癌的早期診斷有重要意義。本研究通過(guò)檢測(cè)宮頸癌患者宮頸組織中Th1/Th2型細(xì)胞因子干擾素γ(IFN-γ)和白介素10(IL-10)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及轉(zhuǎn)錄活性，旨在探討DNA甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系及其在宮頸癌中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年3月—2012年5月在唐山市工人醫(yī)院住院部就診的宮頸癌患者43例為宮頸癌組、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)患者62例為CIN組，另選取同期行全子宮切除的子宮肌瘤患者43例為對(duì)照組。其中宮頸癌組年齡46～59歲，平均(49.8±5.2)歲；病理類(lèi)型均為鱗癌，根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)，高分化鱗癌7例，中分化鱗癌23例，低分化鱗癌13例；根據(jù)FIGO(2000年)臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，I期27例，Ⅱ期13例，Ⅲ～Ⅳ期3例。CIN組年齡40～55歲，平均(48.6±5.1)歲；宮頸上皮內(nèi)瘤變I期(CIN1)23例，宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ/Ⅲ期(CIN2/3)39例。對(duì)照組年齡43～56歲，平均(50.6±5.2)歲。收集三組患者的宮頸組織標(biāo)本，其中對(duì)照組標(biāo)本來(lái)源于子宮肌瘤旁正常宮頸組織，CIN組和宮頸癌組標(biāo)本分別來(lái)源于宮頸活檢和手術(shù)治療，均經(jīng)病理檢查確診。取標(biāo)本前患者均未行化療、放療或免疫治療，收集后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA和總RNA提取 采用飽和酚-氯仿抽提法提取三組宮頸組織DNA，Trizol法提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA和總RNA完整性。

1.2.2 IL-10和IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè) 按照EZ DNA Methylation-GoldTMKit試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)DNA進(jìn)行甲基化修飾及純化。NCBI檢索IL-10(AF418271)和IFN-γ(J00219)基因啟動(dòng)子區(qū)序列，Methyl Primer Express v1.0軟件分析核對(duì)參考引物[4-5]，亞硫酸氫鹽測(cè)序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)檢測(cè)IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)?454～-66，包含6個(gè)甲基化位點(diǎn)(-110、-185、-320、-350、-352、-373)，上游引物：5′-GTTAGTAAGGAGAAGTTTTGGG-3′，下游引物：5′-CATTCATTAAAAAACCACAAT-3′，擴(kuò)增片段389 bp。BSP反應(yīng)體系(50 μl)：PCR Master Mix(美國(guó)Promega)47 μl，上、下游引物(10 μM)各0.5 μl，DNA模板2 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(30個(gè)循環(huán))，72 ℃ 5 min。甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，甲基化引物為：上游5′-AAGAGTTAATATTTTATTAGGGCGA-3′，下游5′-TAAACTCCTTAAATCCTTTAACGAT-3′；非甲基化引物為：上游5′-TGAAGAGTTAATATTTTATTAGGGTGA-3′，下游5′-TAAACTCCTTAAATCCTTTAACAAT-3′，PCR產(chǎn)物片段156 bp。MSP反應(yīng)體系(20 μl)：PCR Master Mix 18 μl，上、下游引物(10 μM)各0.5 μl，DNA模板1 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s、50 ℃ 60 s、72 ℃ 45 s(35個(gè)循環(huán))，72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察條帶。甲基化結(jié)果判斷：僅出現(xiàn)甲基化引物擴(kuò)增154 bp片段產(chǎn)物判別為甲基化，僅出現(xiàn)非甲基化引物擴(kuò)增156 bp片段產(chǎn)物判別為非甲基化，甲基化引物及非甲基化引物均擴(kuò)增出條帶為部分甲基化。

1.2.3 宮頸組織中IL-10和IFN-γ基因mRNA的表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)三組患者宮頸組織中IL-10和IFN-γ基因的mRNA表達(dá)水平[6]。RT-PCR反應(yīng)：按M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶系(美國(guó)GIBCO)說(shuō)明書(shū)操作，加入100 ng隨機(jī)引物和0.5～5.0 μg總RNA及緩沖劑(buffer)混勻后，37 ℃孵育1 h，70 ℃滅活15 min，cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?0 μl PCR反應(yīng)體系：12 μl buffer，上、下游引物各1 μl，cDNA產(chǎn)物2 μl，Taq酶1 μl，加超純水至20 μl混合。反應(yīng)程序：93 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)序列分析 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合DNA序列位點(diǎn)的分析采用TFSEARCH軟件、promoter scan軟件和在線(xiàn)AliBaba 2.1分析工具。把目的序列粘貼在在線(xiàn)軟件提供的粘貼框，按執(zhí)行按鈕即可，具體網(wǎng)址如下：http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html；http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/index.html；http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html。

2 結(jié)果

2.1 三組宮頸組織IL-10和IFN-γ mRNA的表達(dá) 三組IL-10和IFN-γ mRNA水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中宮頸癌組和CIN組IL-10 mRNA水平均高于對(duì)照組，IFN-γ mRNA水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表1)。

2.2 三組IL-10和IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化分析 三組IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-320、-350、-352、-373位點(diǎn)甲基化率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；三組IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-110、-185位點(diǎn)甲基化率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中宮頸癌組和CIN組IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-110位點(diǎn)甲基化率均高于對(duì)照組，宮頸癌組IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-185位點(diǎn)甲基化率低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。不同組織提取DNA的IFN-γ基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)見(jiàn)圖1。宮頸癌組IFN-γ基因啟動(dòng)子甲基化率為34.9%(15/43)，CIN組IFN-γ基因啟動(dòng)子甲基化率為14.5%(9/62)，對(duì)照組IFN-γ基因啟動(dòng)子甲基化率為4.6%(2/43)。三組IFN-γ基因啟動(dòng)子甲基化率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.250，P=0.001)，其中宮頸癌組IFN-γ基因啟動(dòng)子甲基化率高于CIN組，CIN組高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.970，P=0.015；χ2=12.390，P<0.001)。

Table1 Comparison of the level of IL-10 and IFN-γ mRNA among the 3 groups

組別例數(shù)IL-10mRNAIFN-γmRNA對(duì)照組431.35±0.06 1.85±0.08 宮頸癌組432.06±0.12*0.79±0.13*CIN組621.83±0.11*1.68±0.07*F值74.9297.23P值0.000.00

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；IL-10=白介素10，IFN-γ=干擾素γ

表2 三組IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)位點(diǎn)甲基化率比較〔n(%)〕

Table2 Comparison of methylation rates of IL-10 gene promoter among the 3 groups

組別例數(shù)-110-185-320-350-352-373對(duì)照組4332(74.4) 31(72.1) 32(74.4)36(83.7)23(53.5)26(60.5)宮頸癌組4340(93.0)*20(46.5)*26(60.5)33(76.7)24(55.8)23(53.5)CIN組6258(93.5)*45(72.6) 47(75.8)51(82.2)41(66.1)42(67.7)χ2值10.2238.9612.9080.7792.0172.205P值0.0060.0110.2340.6780.3650.332

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

注：N=空白對(duì)照，U=非甲基化，M=甲基化，1=對(duì)照組，2=宮頸癌組，3=CIN1,4=CIN2/3

圖1 MSP檢測(cè)三組IFN-γ基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

Figure1 Methylation of IFN-γ gene promoter by MSP among the 3 groups

2.3 甲基化對(duì)IL-10基因轉(zhuǎn)錄活性的影響 通過(guò)在線(xiàn)軟件TFSEARCH發(fā)現(xiàn)IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)可能包含ER、HSF、HSF或AP-4、CCAAT-box、STAT3或Ets-1共5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域(見(jiàn)圖2)。

圖2 IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

Figure2 Prediction of IL-10 gene promoter and transcription factor binding sites

3 討論

機(jī)體的抗腫瘤作用是以Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主，而Th1向Th2漂移，將造成免疫抑制狀態(tài)，機(jī)體的抗腫瘤免疫將受到嚴(yán)重干擾[7]。IFN-γ是Th1分泌的主要細(xì)胞因子，且可誘導(dǎo)前體T細(xì)胞向Th1分泌，是抗腫瘤免疫中較早出現(xiàn)的細(xì)胞因子；IL-10是一種有助于下調(diào)免疫反應(yīng)的Th2型細(xì)胞因子，具有多種抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答的作用。IL-10升高，不利于抗腫瘤免疫。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌患者IL-10表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，IFN-γ表達(dá)水平明顯降低，呈現(xiàn)出典型的Th2漂移現(xiàn)象，這可能是宮頸癌患者免疫監(jiān)視功能低下的主要原因之一。

DNA甲基化主要在轉(zhuǎn)錄水平抑制細(xì)胞因子基因的表達(dá)[8]，CpG島甲基化與其所在基因的表達(dá)呈反比，即CpG島甲基化程度越高，基因表達(dá)水平越低，反之則越高。本研究對(duì)IL-10和IFN-γ基因的甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，宮頸癌患者IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-185位點(diǎn)甲基化率較低，而IFN-γ甲基化率異常增高，與Viana等[6]研究牙髓炎及Son等[4]研究乳腺癌相關(guān)報(bào)道一致，說(shuō)明DNA甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)異常，造成免疫功能低下，失去對(duì)癌細(xì)胞的免疫監(jiān)視和清除。

DNA甲基化引起基因轉(zhuǎn)錄抑制的機(jī)制主要有3種[9]，即直接作用模式(結(jié)合位點(diǎn)DNA甲基化導(dǎo)致相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子不能識(shí)別與結(jié)合)、間接作用模式(序列特異性的甲基化DNA結(jié)合蛋白與啟動(dòng)子區(qū)甲基化CpG島結(jié)合，募集一些蛋白，形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，從而阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)的靶序列結(jié)合，進(jìn)而影響基因轉(zhuǎn)錄)和改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)模式(DNA的甲基化致使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，抑制基因表達(dá))。前期研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織IL-10基因CpG島的甲基化率較低[10]，且Szalmás等[11]在鱗狀上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)IL-10基因的轉(zhuǎn)錄活性與轉(zhuǎn)錄因子STAT3、Sp1、Ets-1和CCAAT-box有關(guān)。因此，本研究采用BSP進(jìn)一步明確精確位點(diǎn)的甲基化對(duì)IL-10基因轉(zhuǎn)錄活性的可能影響。通過(guò)DNA序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)可能包含ER、HSF、HSF或AP-4、CCAAT-box、STAT3或Ets-1共5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域，其中-110、-185位點(diǎn)的甲基化率在宮頸癌組和對(duì)照組中具有顯著差異，影響CCAAT-box、STAT3和Ets-1與之結(jié)合。有趣的是兩位點(diǎn)甲基化率水平高低在宮頸癌組和對(duì)照組中正好相反，-110位點(diǎn)的甲基化上調(diào)可能影響轉(zhuǎn)錄因子STAT3或Ets-1相關(guān)功能，而-185位點(diǎn)甲基化下調(diào)可能影響轉(zhuǎn)錄因子CCAAT-box的結(jié)合活性增強(qiáng)，進(jìn)而影響IL-10基因在宮頸癌中的表達(dá)水平升高。

綜上所述，IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)域-110、-185位點(diǎn)甲基化狀態(tài)使其在宮頸組織中的分泌表達(dá)增高，IFN-γ甲基化率異常增高，導(dǎo)致其在宮頸組織中的分泌表達(dá)減少，宮頸癌患者處于Th2極化狀態(tài)，與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。表觀遺傳對(duì)細(xì)胞因子基因表達(dá)的調(diào)控除DNA甲基化外，還包括組蛋白乙?；痆12]和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化[13]等方式，但其在宮頸癌發(fā)生中的可能作用將是筆者下一步研究的重點(diǎn)，這將為診斷和免疫治療宮頸癌的研究提供科學(xué)參考。

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