李衛(wèi)華， 劉桂霞， 程家高， 唐 赟

(華東理工大學 藥學院，上海 200237)

0 引 言

新藥的研發(fā)是一項耗資巨大且周期漫長的系統(tǒng)工程。為減少藥物研發(fā)的盲目性和提高研發(fā)的效率，綜合運用物理、化學、生物學和計算機等多學科的技術方法進行合理藥物設計成為當前藥物研發(fā)的主要模式，其發(fā)現(xiàn)新藥的成功率相對隨機篩選有了顯著提高。尤其是隨著高性能計算機的發(fā)展和各種計算算法的完善，以計算機為工具，依據(jù)已有的藥物靶標或已知化合物信息，進行藥物的發(fā)現(xiàn)和設計已成為藥物研發(fā)的一種主要方法[1-3]。利用計算機輔助藥物設計技術，可以有效降低藥物研發(fā)的成本，縮短研發(fā)周期。隨著合理藥物設計發(fā)展起來的一門新興學科——藥物設計學也隨之誕生[4-6]。

近年來，藥學類高校相繼開設了藥物設計類的課程。華東理工大學藥學院于2006年開始開設面向本科生的“藥物設計學”課程，該課程是上海市教委重點建設課程，也是我學院的專業(yè)核心課程之一[7]?！八幬镌O計學”課程的內(nèi)容涉及新藥研究過程中藥物設計的基本原理和方法。和其他高校不同的是，我們的藥物設計學課程主要以介紹計算機輔助藥物設計方法及其應用的相關知識為主[8]。計算機輔助藥物設計是一門新興的交叉學科，涉及多門學科的基礎理論知識，特別是需要掌握一定的數(shù)學和物理基礎知識。純理論的課堂教學往往會使學生產(chǎn)生厭學情趣，從而影響整個課程的教學效果。為培養(yǎng)學生的學習興趣、加深理解，并初步掌握計算機輔助藥物設計的內(nèi)涵，還開設了一門32個學時的“藥物設計實驗”課程來配合理論課教學[9]。該實驗課程突出計算模擬方法在藥物研究中的指導作用，強調(diào)從小分子與靶標相關作用機理入手進行創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)和設計。通過實驗課程，學生不但能鞏固課堂所學理論，還能自己動手開展簡單的藥物設計研究，為今后獨立開展相關研究打下基礎。

目前學術界和一些大制藥企業(yè)使用的計算機輔助藥物設計平臺都是基于一些大型的商業(yè)軟件，如：Schr?dinger、Discovery Studio、MOE、Sybyl等等。這些軟件功能強大，但也很昂貴、對硬件的要求較高，不適用于面向本科生的實驗教學任務。所幸的是，學術界有很多免費的分子模擬軟件以及一些免費的學術版商業(yè)軟件可以完成我們的實驗教學功能。在過去幾年里，我們嘗試將一些能免費獲取的軟件代替商業(yè)軟件應用于我們的實驗課教學，取得了不錯的效果。本文將就這些免費軟件在 “藥物設計實驗”課程中的應用展開介紹。

1 課程內(nèi)容及軟件

綜合計算機輔助藥物設計的國內(nèi)外發(fā)展趨勢和我們多年從事本領域科研工作的經(jīng)驗，并結合藥學專業(yè)背景本科生的知識水平，我們的“藥物設計實驗”共開設了8個實驗內(nèi)容，包括5個基礎型、2個綜合型和1個設計型實驗，具體包括：Unix/Linux系統(tǒng)的基本操作、氨基酸序列比對、蛋白質(zhì)同源模建、小分子構建和結構優(yōu)化、藥效團模型構建、分子對接、虛擬篩選、以及學生自主設計研究方案的設計實驗(見表1)。這些實驗內(nèi)容基本覆蓋了計算機輔助藥物設計所使用到的常規(guī)方法和操作。整個實驗內(nèi)容設計配合理論課教學，由易到難，循序漸進，以便學生能較好掌握。根據(jù)不同的實驗內(nèi)容，我們精心挑選了不同的軟件對學生進行操作技能的訓練，以使學生掌握更多的操作技巧，也可以比較不同軟件的優(yōu)缺點。

表1 藥物設計實驗的內(nèi)容和使用的軟件

2 應用實踐

2.1 Unix/Linux系統(tǒng)的基本操作

由于計算機輔助藥物設計軟件大都基于Linux操作系統(tǒng)，而藥學背景的學生幾乎都沒有Linux系統(tǒng)的使用經(jīng)驗，因此在“藥物設計實驗”中我們首先設置了一個內(nèi)容——Unix/Linux系統(tǒng)的基本操作，讓學生熟悉Linux系統(tǒng)基本命令的操作，如建立自己的工作目錄(mkdir)、復制文件(cp)、移動文件(mv)等等。為后續(xù)實驗內(nèi)容的需要，還要求學生熟練掌握軟件vi的操作技巧。vi是Linux系統(tǒng)自帶的一款優(yōu)秀的文本編輯器，可以方便快速地實現(xiàn)對文本的輸入、添加、修改、替換、查找等等功能。我們將實驗課程必需的一些參數(shù)放到一個公共目錄下，讓學生通過學到的Linux系統(tǒng)命令去獲取這些文件，并通過vi修改其中的某些文件以便自己所需。

2.2 氨基酸序列比對

氨基酸序列比對，即將目標序列同已知參考蛋白序列進行比較分析，是生物信息學及分子生物學強有力的研究手段，它不僅可以用來確定序列保守區(qū)域，同時也為兩個或更多序列的殘基之間的相互關系提供了一個非常明確的圖譜。氨基酸序列比對是研究同源蛋白質(zhì)之間結構功能關系的一種重要方法，也是利用同源模建方法構建蛋白質(zhì)三維結構的基礎。我們選用ClustalX來進行序列比對的操作。ClustalX是一款應用最為廣泛的用于蛋白質(zhì)氨基酸序列比對的免費軟件[10]，其操作界面簡潔，功能簡單易學。首先通過“File”菜單欄里的“Load sequence”和“Append sequence”選項，依次讀入目標和模板蛋白的氨基酸序列；再通過“Alignment”菜單欄里的“Do complete alignment”選項就可以根據(jù)選好的參數(shù)進行兩兩序列或多序列之間的比對；比對好的序列可以保存為多種格式供其它軟件使用，也可以通過“Write alignment as postscript”選項，作為圖片格式進行瀏覽或保存。

2.3 蛋白質(zhì)同源模建

同源模建是根據(jù)氨基酸序列同源性分析，基于同源的已知蛋白質(zhì)結構來預測目標蛋白質(zhì)的三維結構。同源模建是目前蛋白質(zhì)三維結構預測中較為成熟的方法，在蛋白質(zhì)的功能研究和藥物設計中得到了廣泛的應用。目前有許多軟件可以進行蛋白質(zhì)同源模建的工作，其中Modeller是應用最廣的免費軟件。Modeller是美國加州大學舊金山分校的Andrej Sali教授研究組開發(fā)的一款用于同源模建的軟件[11]。它能根據(jù)用戶提供的序列比對結果，自動進行蛋白質(zhì)三維結構的構建。此外，Modeller還可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)結構環(huán)區(qū)(loop區(qū))的從頭模建；依據(jù)特定的勢函數(shù)進行蛋白質(zhì)結構的優(yōu)化；序列比對等等功能。在我們的實驗中，以上一個實驗得到的序列比對結果作為Modeller的輸入文件，用Modeller的內(nèi)部函數(shù)“automodel”可以一步獲得目標蛋白的三維結構。根據(jù)需要，還可以選擇輸出多個結構進行比較分析。Modeller構建的蛋白質(zhì)三維結構的質(zhì)量可以用另一免費軟件Procheck進行評估。Procheck主要從蛋白質(zhì)結構的立體化學特征方面評價模型的好壞，用其產(chǎn)生的拉式圖(Ramachandran plot)可以判斷哪些殘基需要進一步進行優(yōu)化調(diào)整。

2.4 小分子構建與結構優(yōu)化

小分子的構建與結構優(yōu)化是從事藥物設計與分子模擬研究需要掌握的基本技能。在本節(jié)實驗中，主要讓學生掌握如何構建小分子化合物的二維和三維結構，并對其三維結構進行分子力學優(yōu)化。有很多軟件可以實現(xiàn)小分子化合物結構的構建與優(yōu)化操作，為了配合后面實驗內(nèi)容的需要，我們選擇了免費教學版的軟件Maestro。Maestro是一款功能強大的分子圖形顯示和分析軟件，通過組合不同的功能模塊，可以實現(xiàn)計算機輔助藥物設計中絕大多數(shù)方法的應用。

Maestro軟件“Build”面板中的Fragment選項內(nèi)置了一個分子碎片庫，通過選擇不同碎片的組合就可以方便快速地構建一個完整的小分子二維結構。配合“Build”面板上的其它功能按鈕，可以對分子結構進行鍵長、鍵角、二面角、鍵級的調(diào)整；設置可電離基團的形式電荷；原子或基團的移動；改變手性中心的手性等等操作。小分子結構構建完成后，可以利用“Build”面板上的“clean up geometry”進行簡單的結構修正。也可以通過Maestro的“LigPrep”模塊對結構進行分子力學的優(yōu)化?！癓igPrep”模塊提供了MMFF和OPLS_2005兩種分子力場選擇來進行小分子的優(yōu)化。優(yōu)化好的小分子可以保存為多種格式供其它軟件使用，如常用的mol2、pdb、sdf格式等。

2.5 藥效團模型構建

藥效團模建是基于一組結構多樣性的已知活性的小分子，尋找其共同的藥效團特征，從而發(fā)現(xiàn)影響其生物活性的關鍵因素。藥效團模建是基于配體的藥物設計方法中的一種主要方法，可以用于新型藥物先導物的發(fā)現(xiàn)以及研究配體和受體之間的相互作用。

在我們的實驗中，我們利用免費教學版的Phase[12]來構建小分子的三維藥效團模型。先將用于藥效團模建的小分子的三維結構優(yōu)化好，保存為sdf格式，導入分子顯示界面maestro中添加活性數(shù)據(jù)。通過Phase的“Develop pharmacophore model”選項，依據(jù)活性數(shù)據(jù)值，將小分子分為活性組和非活性組，并計算每個小分子的特征元素。然后用“Find common pharmacophore”命令確定它們共同的藥效團，依據(jù)活性組的小分子特征調(diào)整特征元素組合；對產(chǎn)生的可能藥效團假設進行打分，依據(jù)打分的高低排序藥效團。最后依據(jù)實驗數(shù)據(jù)選擇一個最優(yōu)的藥效團模型，利用Maestro界面可以查看活性組和非活性組的小分子和最優(yōu)藥效團模型的匹配情況，以驗證模型的準確度。

2.6 分子對接

分子對接已經(jīng)成為計算機輔助藥物設計領域一個非常重要也非常有效的方法。通過分子對接，可以研究藥物分子和其靶標之間的詳細相互作用，也可以用來發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化新的藥物先導物。能進行分子對接的軟件有很多，有用于小分子配體-受體進行對接的軟件，也有用來進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)分子對接的軟件。在我們的實驗中，我們選擇了AutoDock來進行小分子配體和受體之間的分子對接模擬。AutoDock是由Scripps研究所Arthur J. Olson教授研究組開發(fā)的一款免費分子對接軟件[13]。它采用遺傳算法和模擬退火來尋找配體小分子在受體結合口袋的最佳結合位置，用半經(jīng)驗的自由能評價配體和受體之間的結合親和力。最新的版本不僅能考慮小分子配體的柔性，還可以考慮受體部分殘基的柔性。

在進行分子對接之前，要準備配體小分子和受體大分子的三維結構坐標文件。這部分的準備文件使用免費軟件ADT來完成。通過ADT里面的“Edit”和“Grid”菜單給受體大分子加上氫原子和電荷及溶劑化參數(shù)；通過“Ligand”菜單給配體小分子加氫和電荷。分子對接的結合口袋的定義可以通過“Grid”菜單完成。在“Grid”菜單里可以根據(jù)需要，選擇某個原子、某組原子或者小分子配體為結合口袋的中心，也可以根據(jù)需要定義結合口袋的半徑大小。分子對接需要的配置參數(shù)通過“Docking”菜單完成。一旦所有的參數(shù)文件和坐標文件準備好以后，就可以用AutoDock軟件里的“Autogrid4”和“Autodock4”命令進行網(wǎng)格文件的生成和對接工作。對接結果的分析可以通過ADT的“Analysis”菜單完成，里面可以顯示對接后配體的所有構象，并列出了各個構象的能量、RMSd、排名等信息。一般根據(jù)結合能量值和RMSd值來綜合選擇最優(yōu)的對接結果。

2.7 虛擬篩選

虛擬篩選就是以計算機為工具，對虛擬化合物庫中的化合物與藥物靶標的結合匹配程度進行評估打分，挑選出打分高的化合物進行后續(xù)的活性測試。虛擬篩選技術可以加速藥物發(fā)現(xiàn)的過程，降低研發(fā)成本，現(xiàn)已成為藥物設計領域的一種常規(guī)方法。虛擬篩選可以分為基于藥物靶標的篩選和基于配體小分子的篩選。如果已知靶標的三維結構，可以用基于分子對接的方法進行虛擬篩選；如果靶標三維結構未知，可以用基于配體小分子的方法進行虛擬篩選。在我們的實驗中，我們選用基于分子對接的虛擬篩選方法，分子對接采用免費的DOCK6程序[14]。DOCK是美國加州大學舊金山分校的Irwin Kuntz教授研究組開發(fā)的分子對接程序，是開發(fā)最早的分子對接程序。DOCK程序被廣泛應用于基于受體結構的藥物設計中，在多個藥物靶標中都有成功的應用。

虛擬篩選的第一步是要準備供篩選的小分子化合物庫和靶標蛋白的三維結構。由于受課堂教學時間限制，我們事先準備好了一個含50個小分子化合物的庫供篩選使用，該分子庫的加氫、加電荷等預處理工作均事先完成。靶標分子的三維結構的加氫、加電荷等預處理工作由軟件Chimera完成。Chimera是一款優(yōu)秀的顯示和分析分子結構的免費軟件[15]，能顯示和分析密度圖、超分子組裝、分子對接結果、動力學軌跡和構象系綜等多方面的功能。通過Chimera的“Structure Editing”菜單下的“Dock Prep”選項，方便地給靶標大分子加氫、加電荷和定義電離化殘基的質(zhì)子化狀態(tài)。

準備好小分子庫和靶標蛋白的結構文件后，就需要產(chǎn)生小分子結合口袋的球集文件。這一步依次需要用到三個命令：dms命令生成分子表面；sphgen命令產(chǎn)生球集；sphere_selector命令選擇球集。在這一步中，還需要學生用到第一次實驗內(nèi)容學到的vi編輯器建立各種輸入文件。

利用生成的球集文件，再用命令showbox和grid產(chǎn)生對接所需的網(wǎng)格文件。利用vi編輯器建立一個分子對接的參數(shù)配置文件，最后利用dock6命令完成虛擬篩選工作。篩選的結果可以利用Chimera軟件中“surface/binding analysis”菜單中的“viewDock”選項進行顯示和分析。

3 實踐效果

計算機輔助藥物設計是一門實踐性很強的學科，要反復練習軟件的使用才能掌握其技巧。免費軟件的使用不僅適合實驗室教學，還可以讓學生安裝在自己的手提電腦，方便在課后進行自由練習。我們這種理論結合實踐的教學模式獲得了一定成效。由我們教學團隊指導的本科生先后獲得10余項“大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)實驗計劃”的國家級、市級和校級的立項。由唐赟老師指導的本科生先后獲得第三屆“全國大學生藥苑論壇”的優(yōu)秀論文獎，第四屆的創(chuàng)新成果三等獎，以及第三屆“上海市大學生創(chuàng)新論壇”的優(yōu)秀報告獎。這些軟件都是藥物設計領域的主流軟件，在學術界和制藥工業(yè)界有著廣泛的應用。熟練掌握這些軟件的使用方法和操作技巧，對學生今后從事本領域的工作也能奠定良好的基礎。我們教學團隊培養(yǎng)的學生在國內(nèi)讀研或出國深造的比例超過90%，其中繼續(xù)從事藥物設計研究的占50%以上。

4 結 語

藥物設計學特別是計算機輔助藥物設計在新藥的研發(fā)過程中發(fā)揮著越來越重要的作用。這門新興學科理論性強，對實踐操作要求高，與國際前沿發(fā)展趨勢結合緊密。面向本科生開設以計算機輔助藥物設計為主要內(nèi)容的“藥物設計實驗”課程，是我們學院的一個學科特色。通過能免費得到的分子模擬軟件的操作練習，一方面可以節(jié)約教學的成本，另一方面可以鞏固理論課的課堂教學，加強學生的實踐動手能力，培養(yǎng)他們的研究興趣。現(xiàn)在越來越多的藥學類高校開始重視藥物設計學課程的教學，也希望我們的這些經(jīng)驗能為同行提供一定的借鑒作用。

[1] Ou-yang S H, Lu J Y, Kong X Q,etal. Computational drug discovery [J]. Acta Pharmacologica Sinica, 2012(33): 1131-1140.

[2] 徐筱杰，侯廷軍，喬學斌，等. 計算機輔助藥物分子設計[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2004.

[3] 張禮和，蔣華良. 計算機輔助藥物設計(導讀版)[M]. 北京：科學出版社，2007.

[4] 徐文方. 藥物設計學[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2007.

[5] 仇綴百. 藥物設計學[M].2版. 北京：高等教育出版社，2008.

[6] 郭宗儒. 藥物分子設計[M]. 北京：科學出版社，2005.

[7] 唐 赟. 藥學專業(yè)實驗教程[M]. 上海：華東理工大學出版社，2010.

[8] 劉桂霞，李衛(wèi)華，唐 赟.“藥物設計實驗”課程的建設[J]. 實驗室研究與探索，2010, 29(8): 122-125.

Liu G X, Li W H, Tang Y. Construction of drug design experiment course [J]. Research and Exploration in Laboratory, 2010, 29(8): 122-125.

[9] 劉桂霞，唐 赟. 本科藥物設計學課程建設與實踐[J]. 科教導刊，2009(5): 38-40.

Liu G X, Tang Y. Construction and practice of drug design course for undergraduates [J]. The Guide of Science and Education, 2009(5):38-40.

[10] Larkin M A, Blackshields G, Brown N P,etal. ClustalW and Clustal X version 2.0 [J]. Bioinformatics, 2007(23): 2947-2948.

[11] Sali A, Blundell T L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints [J]. Journal of Molecular Biology, 1993(234): 779-815.

[12] Dixon S L, Smondyrev A M, Knoll E H,etal. PHASE: A new engine for pharmacophore perception, 3D QSAR model development, and 3D database screening. 1. Methodology and preliminary results [J]. Journal of Computer Aided Molecular Design, 2006(20): 647-671.

[13] Morris G M, Huey R, Lindstrom W,etal. Autodock4 and AutoDockTools4: automated docking with selective receptor flexibility [J]. Journal of Computational Chemistry, 2009(16): 2785-2791.

[14] Lang P T, Brozell S R, Mukherjee S,etal. DOCK 6: Combining techniques to model RNA-small molecule complexes [J]. RNA 2009(15): 1219-1230.

[15] Pettersen E F, Goddard T D, Huang C C,etal. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis [J]. Journal of Computational Chemistry, 2004(25):1605-1612.