蔡明宸，張北燦，魯雅文，夏林波，朱江，鄧仕任

（遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連116600）

HPLC法測定不同產地火麻仁藥材中胡蘆巴堿的含量*

蔡明宸，張北燦，魯雅文，夏林波，朱江，鄧仕任

（遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連116600）

目的：建立高效液相色譜測定火麻仁藥材中胡蘆巴堿含量的方法，為2015版藥典火麻仁指標性成分的含量測定項提供依據。方法：采用Hypersil氨基柱，流動相乙腈-水（80∶20，V∶V），檢測波長265nm。結果：胡蘆巴堿進樣量在0.104～1.04μg范圍內線性關系良好，r=0.9999（n=6），加樣回收率100.7%，RSD=1.56%（n=9）；10批火麻仁藥材中胡蘆巴堿的含量為0.6504～0.9931mg·g-1。結論：胡蘆巴堿為火麻仁藥材及飲片中的特征成分，其提取及含測方法操作簡便，結果可靠，可作為火麻仁藥材質量控制的指標性成分。

火麻仁；胡蘆巴堿；高效液相色譜法；中國藥典

火麻仁別名麻子、麻子仁、大麻子，為?？浦参锎舐镃annabissativa L.的干燥成熟果實，臨床上主要用于腸燥便秘，血虛津虧等癥[1，2]。2010藥典中火麻仁藥材僅有性狀鑒別和薄層鑒別項，指標性成分的含量測定項缺失，不利于藥材的質量控制。據文獻報道，火麻仁中含有胡蘆巴堿[3]，經火麻仁醇提取物的化學成分的HPLC分析，并與胡蘆巴堿的標準品對照，最終確定胡蘆巴堿為火麻仁藥材及飲片中的主要生物堿成分。胡蘆巴堿具有抗腫瘤及降血糖的活性作用，還可以有效治療一些皮膚病[4-6]。目前，國內外對火麻仁藥材的報道主要集中脂肪酸類、大麻酚類物質等方面[7，8]，對火麻仁中生物堿進行的含量測定研究甚為少見。本實驗擬以胡蘆巴堿為指標成分，通過對火麻仁中胡蘆巴堿的提取工藝的考察，采用氨基鍵合色譜柱為固定相，建立了火麻仁藥材中胡蘆巴堿的HPLC分析方法，以期為2015版中國藥典中火麻仁的含量測定項提供相關依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

LC-10AT型雙泵高效液相色譜儀（日本島津）；SPD-10AVP紫外檢測器；METTLERAE240型十萬分之一分析天（瑞士METTLER）；FA1004B電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；KQ-250DB型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

胡蘆巴堿對照品（中國藥品生物制品檢定所）（833-200001）；甲醇（A.R.）；乙腈（C.P.天津市大茂化學試劑廠）；水為超純水。

1.2 色譜條件

大連伊力特Hypersil NH2色譜柱（4.6×250 mm，5μm）；流動相乙腈-水（80∶20，V∶V）；流速1.0mL·min-1；檢測波長265nm；柱溫25℃；理論塔板數按胡蘆巴堿峰計算應不低于10000。

1.3 對照品溶液制備及線性關系考察

取胡蘆巴堿對照品2.60mg，精密稱定，置5mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，作為對照品儲備液。精密量取1mL儲備液，置10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成濃度為52μg·mL-1的對照品溶液。進樣量依次為2、6、10、14、18、20μL，以峰面積為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標，得回歸方程為y=1.2×106χ+7650，胡蘆巴堿在0.104～1.04μg范圍內呈良好的線性關系（r=0.9999，n=6）。

1.4 供試品溶液的制備

取胡蘆巴粉末（過40目篩）約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20%甲醇25mL，密塞，稱定重量，放置1h，在20℃下超聲處理10min，超聲3次，冷卻至室溫，再稱定重量，用20%甲醇補足損失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

1.5 精密度實驗

精密稱取同一火麻仁藥材按2.3項下方法制成供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測得保留時間RSD= 0.23%，峰面積RSD=1.05%，表明儀器精密度良好。

1.6 穩(wěn)定性試驗

精密稱取同一火麻仁藥材按2.3項下方法制成供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24h測定峰面積。平均峰面積為588806.5，RSD=1.304%（n=6）。表明供試品溶液在24h內基本穩(wěn)定。

1.7 重復性試驗

精密稱取同一火麻仁樣品6份，按2.3項下方法制成供試品溶液，在2.1項色譜條件下測定，測得樣品中胡蘆巴堿含量的平均值為1.031mg·g-1，RSD=1.055%，證明本方法重復性良好。

1.8 加樣回收率試驗

取已知胡蘆巴堿含量（0.9626mg·g-1）的藥材（產地河北）9份，每份約0.5g，精密稱量，3份為一組，置具塞錐形瓶中，每組精密加入低、中、高濃度胡蘆巴堿對照品貯備液，按2.3項下方法制備供試品溶液，結果平均加樣回收率100.7%，RSD=1.56%（n= 9）。

1.9 樣品含量的測定

分別取不同產地的火麻仁約1g，精密稱定，按2.4項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析，其色譜峰如圖2，記錄下峰面積，代入標準曲線，計算出樣品中含有胡蘆巴堿的含量，結果見表1。

圖1 胡蘆巴堿對照品和樣品的HPLC圖Fig.1 HPLC of reference substance and sample of trigonelline

表1 火麻仁中胡蘆巴堿的含量測定結果Tab.1 Determination resultof trigonelline contentof semen cannabis

2 結果與討論

2.1 對于火麻仁藥材定義的規(guī)范

2005版藥典規(guī)定火麻仁為“?？浦参锎舐椤母稍锍墒旃麑崱?；而2010版藥典則為“桑科植物大麻……的干燥成熟種子”。這種情況在各版中國藥典中反復出現，比較混亂。顯微鑒定表明，大麻的果實是由果皮和種子兩部分組成，而種子則又由種皮和種仁兩部分組成，與文獻記載一致[9]。目前，記載混亂的原因可能是，火麻仁作為潤腸通便的良藥，其有效部位應為種子中的油脂，所以描述為“種子”；然而去除果皮后的種子含油量太高（大于50%），容易酸敗變質而不易保存，因此，該藥材在采收、加工、流通、儲存、銷售等環(huán)節(jié)中，均為果實的形態(tài)，故而描述為“果實”。我們對火麻仁果皮和種子的化學成分進行了初步研究，結果表明二者的成分種類及含量均有著巨大的差別，因此，規(guī)范火麻仁藥材的定義尤為必要。通過對歷代本草著作的考察，我們發(fā)現火麻仁除了潤腸通便作用之外，還有“祛瘀”、“殺蟲”等功效，且以“果實”入藥。綜合考慮其在流通、儲存等過程中的可操作性，以及對目前實際藥材市場的可指導性，初步擬定火麻仁藥材為“?？浦参锎舐椤母稍锍墒旃麑崱?。而去除果皮的種子部分，由于油脂含量較高，藥效較好，且不含有大麻酚類毒性成分，初步將其擬定為火麻仁飲片。

2.2 胡蘆巴堿作為指標性成分的選定原則

由于火麻仁飲片使用的是其種子部分，因此，所選取的指標性成分必須是種子中的特征成分，而不能選取僅在果皮中存在的成分，這樣才能采用同一種指標成分對火麻仁藥材和飲片同時進行質量控制。檢測結果表明，火麻仁果皮和種子中均有的胡蘆巴堿分布，因此，采用胡蘆巴堿作為指標成分是比較適合的。

2.3 2010藥典的檢測方法

2010藥典在測定胡蘆巴藥材中的胡蘆巴堿含量時，選用了C18反相鍵合色譜柱，考慮到反相柱的應用較為普遍，筆者初期也采用了C18作為固定相，該方法在測定生物堿樣品時需要使用十二烷基磺酸鈉等離子對色譜模式。然而，實際操作中發(fā)現，離子對色譜存在以下不足：體系平衡時間較長（約需平衡3h）；色譜峰分離度的重現性不佳；保留時間漂移較大；鹽濃度較高，對色譜柱和色譜儀的壽命影響較大，因此，改用了氨基鍵合硅膠作為固定相。經3根不同品牌氨基柱在3臺不同品牌色譜儀上進行考察，結果表明，當氨基柱柱效不低于10000時，能得到峰型對稱、出峰時間適中、保留時間穩(wěn)定、分離度高的色譜圖，因此，最終選定了氨基鍵合硅膠作為固定相。

2.4 胡蘆巴堿的提取

胡蘆巴堿是一種極性化合物，以內鹽形式存在，易溶于水，甲醇，乙醇等極性溶劑，不溶于乙醚，氯仿等低極性溶劑，文獻在提取方法上多采用超聲提取法[10-12]。本文選擇不同比例的甲醇-水對采用超聲法對其提取，通過單因素考察及正交試驗表明，胡蘆巴堿的最優(yōu)提取工藝為：甲醇濃度為20%，料液比為1∶25，提取時間為10min，溫度為20℃，超聲提取3次。

3 結論

本文對10批不同產地的火麻仁藥材中葫蘆巴堿進行了含量測定，結果分布在0.6504～0.9931 mg·g-1范圍內，初步擬定火麻仁藥材中葫蘆巴堿含量不得低于0.65‰。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］．北京：化學工業(yè)出版社，2010，74．

［2］江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典［M］.上?？茖W技術出版社，1986，498.

［3］中國醫(yī)學科學院藥物研究所.中藥志（第3冊）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1984.266.

［4］荊宇,趙余慶.胡蘆巴化學成分和藥理作用研究進展［J］.中草藥，2003，34（12）：1146-1149.

［5］朱寶立,班永宏,段金廒.胡蘆巴對急性化學性肝損傷的保護作用［J］.中國工業(yè)醫(yī)學雜志，2000，13（1）：19-21．

［6］姜華,尹湉,趙余慶.胡蘆巴堿的生物分布與藥理作用［J］.中草藥，2008，39（4）：附2-附4.

［7］夏林波,郭瑩,鄧仕任.硅膠柱層析-RP-HPLC法同時測定火麻仁中3種大麻酚類化合物的含量［J］.中國藥房，2011，22（27）：2557-2560.

［8］夏林波,鄧仕任,郭瑩.HPLC法測定火麻仁中α-亞麻酸的含量［J］.化學工程師，2011，17（3）：17.

［9］郝虹,李偉廣,李書淵.火麻仁的生藥學研究［J］.中國醫(yī)藥指南，2012，10（27）：83.

［10］劉廣學,尚明英,李輝,等.胡蘆巴藥材中胡蘆巴堿的提取方法及其含量測定［J］.中國藥品標準，2005，6（4）：11-14.

［11］徐雅琴,劉春生,崔崇士.超聲法提取南瓜果肉中胡蘆巴堿最佳提取工藝的研究［J］.現代農業(yè)科技，2009，（10）：7-13.

［12］劉衡,徐春芬,陳英.HPLC法測定不同種天南星中胡蘆巴堿的含量［J］.中國現代藥物應用，2010，4（18）：177-178.

Determ ination of trigonelline in fruit of Cannabis sativa from different origin by HPLC*

CAIMing-chen，ZHANG Bei-can，LU Ya-wen，XIA Lin-bo，ZHIJiang，DENG Shi-ren
（College ofMedicine,Liaoning Uniuersity of Traditional Cheinese Medicine,Dalian 116600,China）

Objective:An HPLCmethod for determination of trigonelline in fruit of Cannabis sativa was developed,to provide a quality controlmethod for 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia.Methods:The chromatography was carried outon a Hypersil amino column（250mm×4.6mm,5μm）with acetonitrile-water（80:20,V∶V）as themobile phase,the detection wavelength was set at 265nm.Results:Trigonelline could be successfully determ ined and the linear rang was 0.104～1.04μg（r=0.9999）.The average recoveries（n=9）of the trigonelline was 100.7%，RSD=1.56%.The content of trigonelline in 10 batches was 0.6504～0.9931mg·g-1.Conclusion: Trigonelline was indeed the specific ingredient in fruit and seed of Cannabis sativa.The method is accurate,reliable and sensitive for quality control of fruitof cannabis sativa.

Cannabis semen;trigonelline;HPLC;Chinese Pharmacopoeia

O657.7

A

1002-1124（2014）07-0029-03

2014-03-26

2015年版中國藥典一部科研立項（火麻仁及飲片）；2013年遼寧省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201310162013）

蔡明宸（1989-），女，碩士研究生，研究方向：中藥炮制。

鄧仕任（1979-），博士，副教授。