史晨輝，王維山，李長俊，張振東，郭風(fēng)勁，陳安民△

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，武漢430030；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，新疆石河子832008）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變和軟骨下骨代謝異常為主要病理特征，伴隨有關(guān)節(jié)周圍骨贅形成、關(guān)節(jié)周圍軟組織攣縮、關(guān)節(jié)滑膜炎性反應(yīng)的關(guān)節(jié)疾患，其以關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙為主要臨床表現(xiàn)［1］。目前研究表明，OA病變與老齡、性別、肥胖、創(chuàng)傷、遺傳等多因素有關(guān)，但是軟骨組織的降解大于合成造成軟骨漸進(jìn)性退變是其最基本的病理改變［2］。在軟骨降解過程中，尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator receptors，uPA）和基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase，MMP-3）發(fā)揮著極其重要的作用［3－4］。有研究表明，uPA可激活軟骨組織及滑膜組織分泌的無活性的前體 MMP-3（Pro-MMP-3），然后同活性 MMP-3共同作用于軟骨組織中膠原蛋白的裂解，因此，抑制軟骨組織及滑膜組織表達(dá)uPA可能是OA防治的一個(gè)途徑［5］。目前，較為成熟的RNA干擾（RNAi）技術(shù)可抑制靶基因的表達(dá)而達(dá)基因沉默效應(yīng)。但通過RNAi技術(shù)抑制uPA間接降低MMP-3表達(dá)的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本課題組在篩選uPA-siRNA靶向序列的基礎(chǔ)上，通過慢病毒包裝并加載GFP，觀察其感染軟骨細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞表達(dá)uPA、MMP-3基因和蛋白的影響，以期為進(jìn)一步研究uPA在OA病變中的防治作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 2月齡新西蘭兔購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，uPA-siRNA序列由本實(shí)驗(yàn)室保存。Lentivirus-NC病毒液和pGLV-H1-GFP＋Puro載體購自上海吉瑪公司。BamHI、EcoRI內(nèi)切酶購自 MBI Fermentas公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑、DMEM／F12培養(yǎng)基均購自Invitrogen公司。Taq酶、質(zhì)粒抽提試劑盒購自Takara公司，uPA和MMP-3抗體均購自Abcam公司。引物合成：采用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)uPA、MMP-3及內(nèi)參基因β-actin檢測(cè)引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法 取原代生長良好的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以每孔1.2×104個(gè)細(xì)胞傳代接種于24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)軟骨細(xì)胞匯合至50%以上時(shí)，按照感染復(fù)數(shù)（MOI）值為1、10和100的病毒細(xì)胞比加入慢病毒顆粒液，共同培養(yǎng)96h后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，確定最佳MOI值。并用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0分析病毒轉(zhuǎn)染效率。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)以最佳MOI值的uPA-siRNA轉(zhuǎn)染組設(shè)立為實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染uPA-siRNA慢病毒載體），同時(shí)設(shè)立不加病毒的空白對(duì)照組（未進(jìn)行任何處理）、空載體組（轉(zhuǎn)染慢病毒載體）和藥物干預(yù)組［加載MMP特異性抑制劑（TIMP）］。實(shí)驗(yàn)組：uPA-siRNA序列經(jīng)慢病毒包裝并加載GFP，通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入兔軟骨細(xì)胞；空載體組：將慢病毒載體通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入兔軟骨細(xì)胞；空白對(duì)照組正常培養(yǎng)軟骨細(xì)胞；藥物對(duì)照組：給予特異性MMP抑制劑。所有細(xì)胞培養(yǎng)96h后應(yīng)用實(shí)時(shí)定量－聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和 Western blot法分別檢測(cè)軟骨細(xì)胞uPA mRNA、MMP-3mRNA和蛋白的表達(dá)水平。PCR產(chǎn)物經(jīng)20g／L瓊脂糖凝膠電泳分離，應(yīng)用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)照相，以及Quantity One軟件分析圖像，mRNA的相對(duì)表達(dá)量以擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的光密度值與β-actin條帶吸光度值之比值表示。Western blot經(jīng)X線片在凝膠成像系統(tǒng)掃描，采用Quantity one軟件分析圖像，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè) 利用倒置熒光顯微鏡觀察4個(gè)序列慢病毒載體在不同MOI時(shí)對(duì)293T細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。隨著MOI的增加，慢病毒的轉(zhuǎn)染效率也隨之增加，當(dāng)MOI為100時(shí)，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)85%以上，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，見圖1。

2.2 軟骨細(xì)胞uPA mRNA和 MMP-3mRNA檢測(cè) 應(yīng)用相對(duì)RT-PCR以β-actin作為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用標(biāo)準(zhǔn)曲線分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組uPA mRNA和MMP－3 mRNA表達(dá)水平顯著降低，而空載體組、空白對(duì)照組和TIMP組uPA mRNA、MMP-3mRNA表達(dá)量較高（P＜0.01）?？蛰d體組與空白對(duì)照組間uPA mRNA、MMP-3mRNA表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖1 慢病毒在不同MOI值下轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞、軟骨細(xì)胞72h后的熒光圖（免疫熒光法，×200）

2.3 軟骨細(xì)胞uPA和 MMP-3蛋白檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組uPA和 MMP-3蛋白表達(dá)水平顯著降低，而空載體組和空白對(duì)照組uPA、MMP-3蛋白表達(dá)量較高（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組與 TIMP組之間uPA蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而 MMP-3蛋白表達(dá)無明顯差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明抑制uPA表達(dá)可降低MMP-3蛋白表達(dá)水平，而TIMP對(duì)uPA表達(dá)無影響，見圖3、4。

圖2 uPA PCR擴(kuò)增曲線及轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞uPA、MMP-3基因表達(dá)水平

圖3 uPA蛋白表達(dá)水平

圖4 MMP-3蛋白表達(dá)水平

3 討 論

隨著社會(huì)老齡化的加重及人口平均壽命的延長，OA已經(jīng)成為嚴(yán)重影響中老年生活質(zhì)量的疾病之一。研究表明，OA以關(guān)節(jié)軟骨組織的退行性改變伴隨有關(guān)節(jié)周圍新生骨的形成為病理特點(diǎn)，以關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙為臨床表現(xiàn)，在OA病變過程中，軟骨下骨也出現(xiàn)骨硬化、骨質(zhì)疏松等代謝異常表現(xiàn)，其復(fù)雜的病理表現(xiàn)給OA的病因?qū)W研究帶來了一定的困難。目前，人們普遍認(rèn)為OA病理變化涉及軟骨組織、軟骨下骨及滑膜在內(nèi)的所有關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)部分，是組織創(chuàng)傷、代謝、基因、遺傳和免疫等多因素作用的結(jié)果［2］。但是其最根本的病理變化是關(guān)節(jié)軟骨組織的降解大于合成，軟骨組織漸進(jìn)性退化后出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)狹窄、關(guān)節(jié)畸形及功能障礙。在軟骨組織的降解過程中，MMPs由于其能廣泛的降解膠原而發(fā)揮著主要的作用。MMPs家族中對(duì)膠原裂解起重要的作用的酶是 MMP-3和MMP-13，但是在軟骨組織收到內(nèi)源性或外源性刺激后，軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞首先分泌的是沒有活性的Pro-MMPs，Pro-MMPs系統(tǒng)在uPA激活Pro-MMP-3為活性的 MMP-3后出現(xiàn)瀑布樣階聯(lián)放大效應(yīng)，大量MMPs被激活從而參與軟骨組織的降解過程［6－7］；而在關(guān)節(jié)組織中存在天然TIMP，其可抑制家族的裂解膠原功能，通常二者保持平衡狀態(tài)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解與合成代謝。但是當(dāng)內(nèi)源性和外源性刺激物持續(xù)存在的情況下，MMPs的分泌多于TIMP從而出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程。已有的文獻(xiàn)證實(shí)［1，8－10］，軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞分泌的uPA在OA早期病變中起著至關(guān)重要的作用，其不但可以促進(jìn)滑膜組織大量分泌IL-1β和TNF－α，后者參與滑膜炎性反應(yīng)加重軟骨降解代謝過程；也可以直接作用于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解；尤為重要的是uPA可以激活 MMP-3酶原，使其活化為活性增強(qiáng)20倍的蛋白降解酶，促進(jìn)軟骨組織膠原的降解，而 MMP-3作為最好的催化劑，激活 Pro-MMP-1，2，13等共同參與軟骨組織的降解過程。因此，通過抑制滑膜組織和軟骨組織中uPA的表達(dá)，可改善軟骨組織中的降解性代謝過程，從而達(dá)到緩解或者改善OA早期軟骨組織的病理變化。

RNAi技術(shù)是近年來發(fā)展起來的高效基因沉默技術(shù)，當(dāng)內(nèi)外源性雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后可引起與其同源的mRNA特異性降解，進(jìn)而抑制相應(yīng)基因表達(dá)，是一種簡單高效的代替基因敲除的新興生物技術(shù)。目前，已經(jīng)在基因功能的研究及部分基因治療方面發(fā)揮了重要的作用［11－12］，研究證實(shí)RNAi基因沉默效果顯著，應(yīng)用微量的siRNA即可使其編碼致病基因產(chǎn)物的含量降低90%以上，一定條件下甚至可達(dá)到基因完全敲除的效果。但目前研究的難度是RNAi表達(dá)載體在目的細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染，現(xiàn)有的化學(xué)方法、電轉(zhuǎn)染、腺病毒載體法等均有轉(zhuǎn)染效率低，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性差等問題。而慢病毒載體能夠成功克服上述問題，可高效轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，尤其是對(duì)原代細(xì)胞和懸浮細(xì)胞等不易感染的細(xì)胞亦有較高的轉(zhuǎn)染效率，且轉(zhuǎn)染穩(wěn)定，目的基因長時(shí)間沉默，能持久的發(fā)揮RNA干擾效應(yīng)［13－14］。筆者構(gòu)建的靶向uPA-siRNA慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞的效率高達(dá)85%，為進(jìn)行OA病理機(jī)制與治療等相關(guān)研究的奠定了重要基礎(chǔ)。

Sato等［10］研究證實(shí)，通過抑制組織中uPA的水平，可間接降低MMP-3的表達(dá)，從而減緩細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程。Korshunov等［15］研究也表明，uPA可快速高效激活Pro-MMP-3為活性的 MMP-3，MMP-3又可快速激活 Pro-MMP-9，大量MMP-3，9又可刺激細(xì)胞分泌更多的uPA，從而在細(xì)胞外基質(zhì)降解病理過程中形成一個(gè)惡性循環(huán)，通過早期干預(yù)，抑制uPA的表達(dá)水平，可顯著減緩組織膠原的降解。筆者前期構(gòu)建了靶向uPA-shRNA序列并進(jìn)行慢病毒包裝，本研究在進(jìn)行慢病毒包裝時(shí)加載了GFP，轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后觀察不同分組之間uPA、MMP-3基因和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示uPA-siRNA慢病毒載體可高效轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，其可顯著抑制uPA、MMP-3基因和蛋白的表達(dá)水平，而同期應(yīng)用 MMP-3抑制劑TIMP后，其只抑制了 MMP-3蛋白的表達(dá)，對(duì)uPA、MMP-3基因和uPA蛋白的表達(dá)未產(chǎn)生任何影響，進(jìn)一步表明沉默uPA在OA病變?cè)缙诨蛑委熤械膬r(jià)值，也間接證明uPA作為調(diào)控MMP-3表達(dá)的上游因子，在MMP-3相關(guān)分子信號(hào)通路中發(fā)揮著極其重要的作用。筆者后續(xù)將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證此項(xiàng)研究結(jié)果，為進(jìn)一步研究uPA基因在OA病變中的作用機(jī)制及其治療作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］ Hochberg MC.Osteoarthritis year 2012in review：clinical［J］.Osteoarthritis Cartilage，2012，20（12）：1465-1469.

［2］ Loeser RF.Aging processes and the development of osteoarthritis［J］.Curr Opin Rheumatol，2013，25（1）：108-113.

［3］ Abramson SB，Attur M.Developments in the scientific understanding of osteoarthritis［J］.Arthritis Res Ther，2009，11（3）：227-231.

［4］ Gepstein A，Arbel G，Blumenfeld I，et al.Association of metalloproteinases，tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，and proteoglycans with development，aging，and osteoarthritis processes in mouse temporomandibular joint［J］.Histochem Cell Biol，2003，120（1）：23-32.

［5］Inuzuka K，Ogata Y，Nagase H，et al.Significance of coexpression of urokinase-type plasminogen activator，and matrix metalloproteinase 3（stromelysin）and 9（gelatinase B）in colorectal carcinoma［J］.J Surg Res，2000，93（2）：211-218.

［6］ Ramos-DeSimone N，Hahn-Dantona E，Sipley J，et al.Activation of matrix metalloproteinase-9（MMP-9）via a con-verging plasmin／stromelysin-1cascade enhances tumor cell invasion［J］.J Biol Chem，1999，274（19）：13066-13076.

［7］ Dreier R，Grassel S，F(xiàn)uchs S，et al.Pro-MMP-9is a specific macrophage product and is activated by osteoarthritic chondrocytes via MMP-3or a MT1-MMP／MMP-13cascade［J］.Exp Cell Res，2004，297（2）：303-312.

［8］ Murphy G，Atkinson S，Ward R，et al.The role of plasminogen activators in the regulation of connective tissue metalloproteinases［J］.Ann N Y Acad Sci，1992，667：1-12.

［9］ Massicotte F，Lajeunesse D，Benderdour M，et al.Can altered production of interleukin-1beta，interleukin-6，transforming growth factor-beta and prostaglandin E（2）by isolated human subchondral osteoblasts identify two subgroups of osteoarthritic patients［J］.Osteoarthritis Cartilage，2002，10（6）：491-500.

［10］Sato T，Tamai H，Kobayashi M，et al.Immunohistochemical properties in the patients with Buerger′s disease－－possible role of plasminogen activator inhibitor-1for preservation of vessel wall architecture［J］.Cardiovasc Pathol，2011，20（5）：266-271.

［11］Jorgensen C，Apparailly F.Prospects for gene therapy in inflammatory arthritis［J］.Best Pract Res Clin Rheumatol，2010，24（4）：541-552.

［12］季丙元，關(guān)晶.siRNA抑制人乳腺癌KLK6基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（1）：33-35.

［13］Sakuma T，Barry MA，Ikeda Y.Lentiviral vectors：basic to translational［J］.Biochem J，2012，443（3）：603-608.

［14］Visse R，Nagase H.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases：structure，function，and biochemistry［J］.Circ Res，2003，92（8）：827-839.

［15］Korshunov VA，Solomatina MA，Plekhanova OS，et al.Plasminogen activator expression correlates with genetic differences in vascular remodeling［J］.J Vasc Res，2004，41（6）：481-490.