廖和和，張云鋒，吳樹強，李寒春，金 磊，任 宏

（1.陜西省核工業(yè)215醫(yī)院腫瘤外科，陜西咸陽712000；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院胸外科，西安710061；3.西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院胸外腫瘤科，西安710077）

A激酶錨定蛋白12（A-kinase anchoring protein 12，AKAP12），在1992年由Gordon等［1］從重癥肌無力患者的血清中分離得到。AKAP12能夠錨定一些重要信號蛋白，參與了信號轉(zhuǎn)導、G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號轉(zhuǎn)導、蛋白定向以及細胞凋亡等過程［2－3］。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，AKAP12在多種腫瘤中表達下降或缺失［4－5］，能夠抑制腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移［6－7］。目前，研究發(fā)現(xiàn)，外周血中存在高水平的游離DNA，其中很大一部分來源于凋亡或者壞死的腫瘤細胞，因此，檢測血液標本中異常甲基化的DNA，能對疾病的診斷、預后及復發(fā)等提供新思路［8］。本研究采用甲基化特異－高分辨融解曲線法（MS-HRM）檢測肺癌外周血細胞游離DNA中AKAP12基因甲基化程度，并結(jié)合患者病理參數(shù)進行分析研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年1月至2011年12月在陜西省核工業(yè)215醫(yī)院和西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院就診的60例肺癌患者，其中男32例，女28例，年齡28～76歲，平均（48.0±12.6）歲；均經(jīng)病理確診，Ⅰ期9例，Ⅱ期19例，Ⅲ期29例，Ⅳ3例；分化好及中等34例，分化差26例。收集患者外周血2～3 mL，分離去血清，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與材料 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit、Hot Star Taq Master Mix（Qiagen 公 司），EZ DNA Methylation-Gold Kit（ZYMO 公司），SYTO 9Green Fuorescent Nucleic Acid Stain（Invitrogen公司），CpGenome Universal Methylated DNA（Millipore公司）。PCR基因擴增儀（Bio-Rad公司），Rotor-Gene 6000熒光定量 PCR 儀（Corbett公司），NanoDrop ND-2000分光光度計（Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 分離血清，用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取細胞游離DNA，NanoDrop ND-2000（超微量紫外分光光度儀上）檢測DNA濃度及質(zhì)量，要求光密度（OD）值（A260／A280）約為1.80～2.00，調(diào)整DNA濃度至10ng／μL。1.3.2 甲基化修飾 取上述DNA樣本1ng，使用EZ DNA Methylation Gold Kit，按照說明書進行甲基化修飾。

1.3.3 引物設計 使用軟件MethyPrimer設計引物，引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。上游引物序列：5′-GGC GGT TGT TTG GAT TTG GGT T-3′，長度83bp，下游引物序列：5′-AAC ACG CCC TAC AAC AAC ATC TA-3′），長度83bp。

1.3.4 構(gòu)建標準品 以 CpGenome Universal Methylated DNA（Millipore公司）作為100%甲基化的標準品，以100%非甲基化的健康人外周血DNA作為稀釋劑，按不同比例搭配制成100% 、80%、60%、40%、20% 、10%、5%、1% 和 0 甲 基 化 程度的標準品，進行下一步的HRM曲線分析后得到標準曲線圖。

1.3.5 MS-HRM測定 AKAP12啟動子區(qū)甲基化擴增條件：預變性95℃5min，1個循環(huán)；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃5min延伸。使用PCR基因擴增儀擴增后，使用Rotor-Gene 6000進行高分辨率熔解曲線分析：樣本經(jīng)95℃2min，40℃2min預處理后，溶解時溫度由76℃逐漸升高到88℃，每升高0.1℃需記錄數(shù)值。獲得 MS-HRM曲線圖。待測標本需按照標準曲線上來測定其甲基化程度。

1.3.6 重復性檢測 HRM方法檢測重復性，采用取100%～0系列濃度的甲基化標準品重復檢測2次，觀察HRM曲線的相符程度。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數(shù)資料以率（%）表示，AKAP12甲基化與病理參數(shù)比較，采用χ2檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MS-HRM標準曲線和重復性試驗結(jié)果 分別將100%～0甲基化標準品基因擴增后進行HRM曲線檢測，得到標準曲線圖（圖1）。待測標本的甲基化程度可參照100%～0系列濃度曲線中的相應曲線得出。同時，取100%～0甲基化標準品重復檢測2次，得到的HRM曲線形狀基本一致。

圖1 MS-HRM法檢測AKAP12基因甲基化程度的標準曲線圖

2.2 MS-HRM檢測AKAP12基因甲基化結(jié)果 從60例肺癌患者標本中檢出34例（56.7%）AKAP12基因甲基化，其中，18例（52.9%）甲基化程度為1%～20%，14例（41.2%）為20%～60%，2例（5.88%）為60%～100%。

2.3 外周血AKAP 12基因甲基化與患者病理參數(shù)相關(guān)性檢測 外周血中AKAP12基因甲基化水平在不同患者年齡和性別中比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而與肺癌的病理分期和分化程度比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 外周血AKAP12基因甲基化與肺癌患者關(guān)系

續(xù)表2 外周血AKAP12基因甲基化與肺癌患者關(guān)系

3 討 論

近年來，關(guān)于體液中（血液、尿液、唾液及痰液等）細胞游離DNA的研究得到越來越多的關(guān)注。目前，認為腫瘤患者血液游離DNA主要來自凋亡細胞、腫瘤細胞以及淋巴細胞等，其中來源于凋亡細胞或壞死腫瘤細胞占較大比例（可高達93%）［8］。目前，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，體液游離DNA抑癌基因啟動子CpG島的異常高甲基化常常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后以及復發(fā)等密切相關(guān)［9－11］。因此，體液標本中游離DNA甲基化水平可以為腫瘤早期篩查、早期診斷、轉(zhuǎn)移及復發(fā)監(jiān)測的一項重要指標，并能有助于早期發(fā)現(xiàn)有癌變傾向的細胞［12］。

AKAP12能夠錨定一些重要信號蛋白，主要參與蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）復合物的形成，細胞骨架的重塑，β2腎上腺素受體復合物的調(diào)節(jié)及細胞凋亡等過程［2－3］。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，AKAP12在多種腫瘤中表達下降或缺失，可見于黑色素瘤、乳腺癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、食管腺癌、骨肉瘤、前列腺癌、胃癌、血液系統(tǒng)惡性腫瘤等［4－5］，提示 AKAP12可能為一種潛在的抑癌基因。此外，研究還發(fā)現(xiàn)AKAP12具有抑制腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移，阻滯細胞周期以及促進細胞凋亡等作用［13－14］。目前，已經(jīng)在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)AKAP12的高甲基化現(xiàn)象，Choi等［15］在胃癌組織和細胞株中發(fā)現(xiàn)高甲基化（56%）的存在，且與AKAP12表達缺失相對應。

本研究通過建立MS-HRM，檢測50例肺癌患者外周血游離DNA中AKAP12啟動子的甲基化狀況，以此探討肺癌患者外周血AKAP12高甲基化與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。MS-HRM作為一種先進的技術(shù)手段，具有較高的靈敏度、特異性和重復性，利用此方法可以檢測出最低1%的基因甲基化，這大大提高了肺癌的檢出率，有利于進行高危人群的篩選，早期診斷，轉(zhuǎn)移和復發(fā)的監(jiān)測。本研究結(jié)果顯示，34例（56.7%）肺癌患者標本中檢出AKAP12基因甲基化，其中，18例（52.9%）甲基化程度為1%～20%，14例（41.2%）為20%～60%，2例（5.88%）為60%～100%。隨后，筆者研究了肺癌患者外周血AKAP12基因甲基化水平與病理參數(shù)的相關(guān)性，研究表明患者年齡、性別與AKAP12甲基化水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而肺癌的病理分期和分化程度與AKAP12甲基化水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示AKAP12的甲基化與肺癌的進展有關(guān)，可以用來評估肺癌的分期和惡性程度。

綜上所述，腫瘤中抑癌基因的高甲基化現(xiàn)象普遍存在，單個基因的甲基化往往不能完整反映腫瘤的基本情況，而進一步研究表明每種抑癌基因都存在不同的啟動子甲基化模式，因此，對于AKAP12基因啟動子甲基化研究為臨床上多方面、多角度監(jiān)測腫瘤提供了一個重要指標。

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