孫曉艷，王亞帝，何東寧，李 萍，哈敏文

腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性和耐受性存在個(gè)體差異，可能是導(dǎo)致化療失敗、病情進(jìn)展的重要原因。目前，國(guó)內(nèi)外已對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)的多種化療預(yù)后因子進(jìn)行了研究，為NSCLC的分子分型及個(gè)體化治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但有些預(yù)后因子的特異性并未達(dá)到理想的效果，研究結(jié)果仍存在爭(zhēng)議，如BAG-1蛋白。BAG-1蛋白能與多種基因蛋白產(chǎn)物相作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。BAG-1基因編碼的產(chǎn)物BAG-1蛋白有4個(gè)異構(gòu)體，均是由1條mRNA鏈通過選擇性剪切翻譯而成的，其中3個(gè)主要的異構(gòu)體是BAG-1L、BAG-1M和BAG-1S蛋白。BAG-1蛋白雖是抗凋亡蛋白，但其對(duì)預(yù)后的意義有一定爭(zhēng)議，認(rèn)為與BAG-1蛋白的優(yōu)勢(shì)亞型有關(guān)。王慧等[1]研究發(fā)現(xiàn)在大腸癌中BAG-1L蛋白表達(dá)水平越高，其惡性程度越高，臨床預(yù)后越差；Millar等[2]認(rèn)為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的核型BAG-1蛋白即BAG-1L蛋白的高表達(dá)提示局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率低，其預(yù)后較好；Rorke等[3]研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC細(xì)胞質(zhì)中BAG-1蛋白的高表達(dá)與患者生存期的延長(zhǎng)相關(guān)。環(huán)氧化酶-2(COX-2)蛋白在多種腫瘤組織中高表達(dá)，能促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，延緩凋亡，致使癌癥患者預(yù)后較差。郭琰[4]通過對(duì)胃癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)COX-2蛋白能夠激活上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。BAG-1蛋白促進(jìn)抗細(xì)胞凋亡的能力也是通過與Bcl-2形成復(fù)合物并上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，最終使生存期延長(zhǎng)。BAG-1與COX-2蛋白可能通過某種通路影響NSCLC的預(yù)后。

本研究采用免疫組化法和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)BAG-1蛋白的不同亞型及COX-2蛋白在NSCLC中的表達(dá)，探討NSCLC的BAG-1預(yù)后優(yōu)勢(shì)亞型，探討聯(lián)合檢測(cè)BAG-1與COX-2蛋白的表達(dá)對(duì)NSCLC預(yù)后的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年1月—2010年1月于遼寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行肺癌手術(shù)且術(shù)后行6～8個(gè)周期化療的120例NSCLC患者的手術(shù)病理標(biāo)本，其中男62例，女58例，年齡45～76歲，中位年齡66歲；鱗癌54例，腺癌66例；高分化癌46例，中分化癌31例，低分化癌43例；按臨床術(shù)后外科病理分期(p-TNM)分為Ⅰ期22例、Ⅱ期42例、Ⅲ期56例(美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)2002年分期標(biāo)準(zhǔn))；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者45例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者75例。從化療結(jié)束開始每3個(gè)月對(duì)患者行電話隨訪1次，隨訪截止日期為2013年6月。根據(jù)臨床隨訪資料進(jìn)行回顧性研究，分析BAG-1S和COX-2蛋白表達(dá)與性別、年齡、病理類型、分化程度、病理分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1.2 BAG-1蛋白和COX-2蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)BAG-1蛋白和COX-2蛋白的表達(dá)，鼠抗BAG-1多克隆抗體(CC9E8，工作稀釋度為1∶15)購(gòu)自Santa Cruz，兔抗COX-2多克隆抗體工作液、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。按SP免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 BAG-1S mRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用石蠟包埋組織提取RNA及RT-PCR方法檢測(cè)BAG-1S mRNA的表達(dá)。石蠟包埋組織40 μm，EASY spin石蠟包埋組織RNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司(目錄號(hào) RN30)，PrimeScript RT-PCR Kit購(gòu)自大連寶生物工程有限公司(DRR014A)。

1.4 結(jié)果判定 BAG-1蛋白和COX-2蛋白表達(dá)：于免疫染色最多的區(qū)域計(jì)數(shù)1 000個(gè)肺癌細(xì)胞，觀察細(xì)胞著色程度，計(jì)算其陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。著色強(qiáng)度評(píng)分：無色(-)為0分，淺黃色(+)為1分，棕黃色(++)為2分，深棕色(+++)為3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評(píng)分：0為0分，<25 %為1分，26 %～50 %為2分，51 %～75 %為3分，76 %～100 %為4分。細(xì)胞著色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)得分之和≥3分即為免疫組化染色陽(yáng)性。PCR產(chǎn)物：10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物在1 % 瓊脂糖(Agarose)凝膠(含有EB)中150 V電泳30 min，同時(shí)以5 μl標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA Marker 2 000 bp作為參照，電泳結(jié)束后，紫外燈下觀察結(jié)果并照相。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)；BAG-1S和COX-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析；繪制生存曲線，生存數(shù)據(jù)的分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)；采用Cox回歸模型進(jìn)行生存期的多因素分析，納入的自變量為年齡、性別、病理類型、分化程度、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、BAG-1S蛋白表達(dá)和COX-2蛋白表達(dá)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 BAG-1蛋白和COX-2蛋白表達(dá) BAG-1蛋白在胞質(zhì)及胞核均有表達(dá)，共有103例陽(yáng)性表達(dá)，單獨(dú)在胞質(zhì)表達(dá)41例，單獨(dú)在胞核表達(dá)12例，在胞質(zhì)和胞核同時(shí)表達(dá)50例。COX-2蛋白主要在胞質(zhì)表達(dá)，共有67例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為55.8%(見圖1～6)。

2.2 RT-PCR產(chǎn)物 BAG-1S mRNA陽(yáng)性表達(dá)73例，陽(yáng)性表達(dá)率為60.8%(見圖7)。

圖7 BAG-1S mRNA陽(yáng)性表達(dá)Figure 7 The positive expression of BAG-1S mRNA

2.3 BAG-1S蛋白和COX-2蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 不同分化程度NSCLC患者BAG-1S蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.551，P=0.005)；不同病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者COX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.069、7.320，P=0.003、0.007，見表1)。

圖1 BAG-1蛋白在胞質(zhì)表達(dá)(SP法，×400)
Figure1 BAG-1 protein expression in the cytoplasm

圖2 BAG-1蛋白在胞質(zhì)、胞核同時(shí)表達(dá)(SP法，×400)
Figure2 BAG-1 protein expression in the cytoplasm and the nucleus

圖3 BAG-1蛋白在胞核表達(dá)(SP法，×400)
Figure3 BAG-1 protein expression in the nucleus

圖4 BAG-1蛋白表達(dá)陰性對(duì)照(SP法，×400)
Figure4 BAG-1 protein expression in the negative control

圖5 COX-2蛋白在胞質(zhì)表達(dá)(SP法，×400)
Figure5 COX-2 protein expression in the cytoplasm

圖6 COX-2蛋白在胞核表達(dá)(SP法，×400)
Figure6 COX-2 protein expression in the nucleus

表1 不同臨床特征患者BAG-1S和COX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較〔n(%)〕Table 1 Comparison of BAG-1S and COX-2 protein positive expression rate in patients with different characteristics

2.4 生存曲線比較 BAG-1S蛋白陽(yáng)性表達(dá)、BAG-1L/M蛋白陽(yáng)性表達(dá)、BAG-1蛋白陰性表達(dá)患者的總生存期(OS)、無進(jìn)展生存期(PFS)分別為39.482、36.414、35.806個(gè)月，25.760、24.235、23.925個(gè)月。BAG-1S蛋白陽(yáng)性表達(dá)、BAG-1L/M蛋白陽(yáng)性表達(dá)、BAG-1蛋白陰性表達(dá)患者的OS、PFS比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=37.191、35.051，P<0.001)，BAG-1L/M蛋白陽(yáng)性表達(dá)與BAG-1蛋白陰性表達(dá)患者的OS、PFS比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.220、1.209，P=0.269、0.272，見圖8、9)。

COX-2蛋白陽(yáng)性與陰性表達(dá)患者的OS(37.671、39.007個(gè)月)、PFS(24.861、25.520個(gè)月)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.605、4.232，P=0.032、0.040，見圖10、11)。

BAG-1S、COX-2蛋白單獨(dú)陽(yáng)性表達(dá)及二者同時(shí)表達(dá)的OS(41.516、35.948、38.330個(gè)月)、PFS(26.805、24.056、25.173個(gè)月)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.246、28.442，P<0.001，見圖12、13)。

圖8注：OS=總生存期

圖8 BAG-1不同亞型蛋白表達(dá)患者的OS曲線
Figure8 OS curves of patients in BAG-1 protein expression with different subtypes

圖9注：PFS=無進(jìn)展生存期

圖9 BAG-1不同亞型蛋白表達(dá)患者的PFS曲線
Figure9 PFS curves of patients in BAG-1 protein expression with different subtypes

圖10 COX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的OS曲線
Figure10 OS curves of patients in COX-2 positive expression or not

圖11 COX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的PFS曲線
Figure11 PFS curves of patients in COX-2 positive expression or not

圖12 BAG-1S、COX-2各自陽(yáng)性表達(dá)及二者同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)患者的OS曲線
Figure12 OS curves of patients in BAG-1S,COX-2 respectively positive expression and both are positive expression

圖13 BAG-1S、COX-2各自陽(yáng)性表達(dá)及二者同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)患者的PFS曲線
Figure13 PFS curves of patients in BAG-1S,COX-2 respectively expression and both are positive expression

2.5 Spearman秩相關(guān)分析 BAG-1S蛋白與COX-2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.180，P=0.049)。

2.6 Cox回歸分析 Cox回歸分析顯示BAG-1S蛋白、COX-2蛋白、分化程度、病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NSCLC患者生存期的影響因素(見表2)。

表2 NSCLC患者生存期的Cox回歸分析Table 2 Cox regression analysis of survival time for NSCLC patients

3 討論

病理組織分型曾是預(yù)測(cè)NSCLC治療效果的重要指標(biāo)。但目前隨著分子生物學(xué)及遺傳學(xué)的進(jìn)展，逐漸認(rèn)識(shí)到腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅在病理，而且在遺傳及基因表型等方面同樣具有異質(zhì)性，目前結(jié)合分子生物學(xué)標(biāo)記等預(yù)測(cè)指標(biāo)，已成為指導(dǎo)NSCLC臨床個(gè)體化治療及預(yù)測(cè)療效的重要研究方向。

BAG-1基因是一種抗凋亡基因，其編碼產(chǎn)物能與多種基因蛋白產(chǎn)物相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。BAG-1蛋白在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，但表達(dá)的意義不盡相同[5-10]。Dzhagalov 等[11]發(fā)現(xiàn) BAG-1蛋白表達(dá)陰性的肺癌患者PFS和OS明顯延長(zhǎng)。但Rorke等[3]研究發(fā)現(xiàn)，BAG-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)組患者的PFS及5 年生存率均高于陰性表達(dá)組?？紤]可能與BAG-1蛋白的優(yōu)勢(shì)亞型有關(guān)，不同亞型的BAG-1蛋白過表達(dá)在細(xì)胞中的分布與腫瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系仍有爭(zhēng)議。Rorke等[3]發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)中BAG-1蛋白表達(dá)情況與較長(zhǎng)的OS相關(guān)。而汪小沅[12]得出的結(jié)論與Rorke相反，其認(rèn)為腫瘤胞核中BAG-1蛋白的過表達(dá)與死亡風(fēng)險(xiǎn)減低相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)BAG-1蛋白在NSCLC中高表達(dá)，其中BAG-1S蛋白是NSCLC患者的預(yù)后優(yōu)勢(shì)亞型，可以延長(zhǎng)患者的預(yù)后生存期，而BAG-1L/M蛋白對(duì)患者的預(yù)后無影響，BAG-1L/M蛋白陽(yáng)性表達(dá)者的期與陰性表達(dá)者間無明顯差異，年齡、性別、病理類型、病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)BAG-1S蛋白的表達(dá)無影響。

BAG-1基因是抗凋亡基因,理論上該蛋白的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致患者的預(yù)后較差,而部分研究的結(jié)論恰恰相反,對(duì)于這一矛盾，Dzhagalov等[11]推測(cè)可能與不同個(gè)體內(nèi)BAG-1不同亞型蛋白的表達(dá)有關(guān)。這種矛盾關(guān)系在Bcl-2的抗凋亡活動(dòng)中同樣存在[13]。本研究發(fā)現(xiàn)BAG-1S蛋白在NSCLC組織中高表達(dá)，是NSCLC患者的預(yù)后優(yōu)勢(shì)亞型，但其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

大量研究表明COX-2蛋白在大多數(shù)腫瘤中高表達(dá)，Jiang等[14]通過Meta分析得出COX-2蛋白的表達(dá)狀態(tài)是NSCLC的獨(dú)立預(yù)后因素，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)。COX-2蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用，其過表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞分裂。研究發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)與腫瘤侵襲性和不良預(yù)后有關(guān)[15-16]。本研究結(jié)果顯示：COX-2蛋白在NSCLC中高表達(dá)，病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能是其表達(dá)的影響因素，而其陰性表達(dá)患者的預(yù)后生存期明顯長(zhǎng)于陽(yáng)性表達(dá)者。

本研究顯示：BAG-1S與COX-2蛋白在NSCLC中的表達(dá)呈正相關(guān)，BAG-1S蛋白、COX-2蛋白、分化程度、病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)患者的生存期有影響。BAG-1S及COX-2蛋白同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)的患者生存期明顯長(zhǎng)于單獨(dú)COX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)者，但低于單獨(dú)BAG-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)者。吳倩等[17]、Wang等[18]和 Liu等[19]報(bào)道，BAG-1基因在NSCLC中的表達(dá)可能與鉑類藥物的化療敏感性相關(guān)。本研究患者均接受化療藥物治療，可能導(dǎo)致BAG-1S及COX-2蛋白對(duì)化療藥物的敏感性增加。

BAG-1基因是抗凋亡基因，但本研究發(fā)現(xiàn)BAG-1S蛋白陽(yáng)性表達(dá)具有生存優(yōu)勢(shì)，可能是其對(duì)化療藥物敏感所致；COX-2蛋白同樣具有重要的預(yù)后作用。BAG-1S及COX-2蛋白既是預(yù)后的獨(dú)立影響因素，又能相互作用影響。因此，在腫瘤的臨床治療中，可以聯(lián)合檢測(cè)BAG-1S、COX-2蛋白預(yù)測(cè)NSCLC預(yù)后，又可以根據(jù)兩因子的相互關(guān)系指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。

本研究未對(duì)BCL-2蛋白進(jìn)行檢測(cè)，今后的研究中將對(duì)BAG-1S及COX-2相關(guān)通路進(jìn)行研究，并研究BAG-1S的作用機(jī)制。

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