劉紅英，楊利麗，楊和軍，劉順梅，張金寶

近年來(lái)，隨著人們對(duì)于遺傳疾病危害的認(rèn)識(shí)逐漸加深，產(chǎn)前診斷越來(lái)越受到關(guān)注。由于傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法對(duì)于孕婦及胎兒均存在一定的傷害，因此，無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷成為近年來(lái)眾多學(xué)者的研究熱點(diǎn)之一[1]。母血中胎兒特異性RNA的發(fā)現(xiàn)為無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的研究開(kāi)辟了新的篇章[2]。本研究通過(guò)對(duì)孕婦外周血胎兒ε血紅蛋白基因mRNA的定量分析，闡述ε血紅蛋白基因mRNA的濃度與孕齡之間的關(guān)系，從而為進(jìn)一步臨床診斷方案的選擇提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年10月—2009年11月在濰坊市人民醫(yī)院行產(chǎn)前檢查的7～16周正常單胎妊娠孕婦30例為研究對(duì)象，年齡25～37歲；第一次妊娠9例，多次妊娠21例。均無(wú)內(nèi)外科疾病和吸煙史，均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集和處理 取孕婦空腹肘靜脈血5 ml，置于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝的試管中，5 ml全血加入10 ml 異硫氰酸胍裂解液，快速而徹底的勻漿，并分裝到1.5 ml的離心管中，每管裝1 ml全血異硫氰酸胍裂解液。

1.2.2 全血RNA的提取和檢測(cè) 常規(guī)方法提取孕婦全血RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度，判斷RNA的濃度和純度是否符合要求。

1.2.3 胎兒ε血紅蛋白基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 使用AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，總反應(yīng)體系20 μl，其中RNA 5 μl，5倍反應(yīng)緩沖液4 μl，Rnase inhibitor(20 U/μl) 1 μl，dNTP mix(10 mmol/L) 2 μl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(10 U/L) 2 μl，逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后產(chǎn)物于-70 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增胎兒血紅蛋白ε基因，上游引物5′-TTTTACTGCTGAGGAGAAGGCTGCC-3′，下游引物5′-CTTGCCAAAGTGAGTAGCCAGAATAA-3′。以GAPDH基因作為內(nèi)參，引物如下：上游引物5′-TGGTCTCCTCTGACTTCAAC-3′，下游引物5′-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3′。PCR循環(huán)周期條件：變性94 ℃ 60 s，退火57 ℃ 120 s，延伸72 ℃ 120 s，共35個(gè)循環(huán)，然后72 ℃ 延伸 8 min，于 4 ℃ 條件下終止反應(yīng)。

1.2.4 對(duì)胎兒血紅蛋白基因ε序列擴(kuò)增產(chǎn)物的定量分析 利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)血紅蛋白基因ε序列擴(kuò)增產(chǎn)物陽(yáng)性樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用ImageJ軟件對(duì)每條電泳條帶進(jìn)行圖像分析，測(cè)定電泳條帶的灰度值。計(jì)算孕婦外周血中ε血紅蛋白基因mRNA 的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用Spearman秩相關(guān)分析研究外周血中ε血紅蛋白基因mRNA濃度與孕齡之間的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕婦外周血總RNA的質(zhì)量濃度及純度測(cè)定 30例樣品RNA質(zhì)量濃度值為0.98～3.19 g/L，平均(1.87±0.76)g/L；光密度平均比值為1.79，所提全血總RNA具有較高的質(zhì)量濃度及純度(見(jiàn)圖1)。

2.2 胎兒ε血紅蛋白基因mRNA的體外擴(kuò)增結(jié)果 樣品的凝膠電泳圖像見(jiàn)圖2，30例樣品中，7例陽(yáng)性，23例陰性。根據(jù)電泳條帶灰度值，計(jì)算血紅蛋白基因ε序列mRNA的表達(dá)濃度(見(jiàn)表1)。孕婦外周血中胎兒ε血紅蛋白基因mRNA 濃度為0.537～1.790 μg/ml，中位數(shù)為1.241 μg/ml。孕婦外周血中胎兒ε血紅蛋白基因mRNA的濃度與孕齡呈負(fù)相關(guān)(r=-0.750，P=0.026，見(jiàn)圖3)。

注：泳道1～5均為孕婦外周血RNA樣本

圖1 血液總RNA電泳條帶

Figure1 Electrophoresis result of whole-RNA extracted from maternal blood

注：泳道1為DNA marker(100～1 000 bp)，泳道2～6為ε血紅蛋白基因mRNA RT-PCR產(chǎn)物，長(zhǎng)度為355 bp，泳道7為GAPDH mRNA 標(biāo)準(zhǔn)品RT-PCR產(chǎn)物，長(zhǎng)度為222 bp，泳道8為空白對(duì)照

圖2 胎兒ε血紅蛋白基因mRNA RT-PCR電泳圖

Figure2 Electrophoresis result of ε hemoglobin gene mRNA after RT-PCR

3 討論

圖3 孕婦外周血中ε血紅蛋白基因mRNA的濃度與孕齡的相關(guān)性

Figure3 The concentration of ε hemoglobin gene mRNA in different pregnant woman′s blood

表1 胎兒ε血紅蛋白基因mRNA凝膠成像結(jié)果

無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷一直是近幾年來(lái)醫(yī)學(xué)工作者的研究重點(diǎn)之一，母血中胎兒遺傳物質(zhì)的識(shí)別和收集正是這項(xiàng)研究的靶點(diǎn)[3]。研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)人們已經(jīng)陸續(xù)從母血中分離到了胎兒的有核紅細(xì)胞[4]和胎兒DNA[5]，為無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的實(shí)施奠定了基礎(chǔ)。但由于有核紅細(xì)胞和胎兒DNA存在分離困難、龐大母體背景影響等缺點(diǎn)[6]，因此，母血中胎兒RNA的分離應(yīng)用備受關(guān)注。本研究著重探討了從母血中分離收集胎兒ε血紅蛋白基因mRNA的方法，并分析了其表達(dá)水平與孕齡的關(guān)系，為臨床無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的具體實(shí)施提供了理論依據(jù)。

在胚胎發(fā)育早期，胎兒體內(nèi)的血紅蛋白主要有Hb Gower1(ζ2ε 2)和Hb Gower2(α2ε2)兩種類型；到胚胎發(fā)育第8周后，則以HbF(α2γ2)為主；出生后至成人期則以HbA(α2β2)為主[7]。從上述血紅蛋白出現(xiàn)的不同時(shí)間及其不同的分子式可以看出，血紅蛋白的各種基因表達(dá)時(shí)間和表達(dá)豐度會(huì)隨著胚胎的發(fā)育不斷的發(fā)生變化。因此，本研究選擇孕7～16周的早孕婦女為研究對(duì)象，從母血中分離胎兒ε血紅蛋白基因mRNA，并探討其與孕齡的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕婦外周血中確實(shí)存在胎兒ε血紅蛋白基因mRNA，而且其含量在孕7～10周與孕齡呈負(fù)相關(guān)。此結(jié)果與國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究基本一致[8]。

本研究選擇的30例標(biāo)本中只有7 例陽(yáng)性，其余23 例均為陰性，分析原因發(fā)現(xiàn)，23 例陰性者大都為10～16周的孕婦，故提示在臨床應(yīng)用母血中胎兒ε血紅蛋白基因mRNA做產(chǎn)前診斷時(shí)，應(yīng)選擇在孕7～10周進(jìn)行，且由于其含量與孕齡呈負(fù)相關(guān)，因此越早越好。

綜上所述，與胎兒有核紅細(xì)胞和胎兒DNA相比，胎兒mRNA具有分離容易、不受母體背景影響等優(yōu)點(diǎn)，因此胎兒mRNA用于無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷具有切實(shí)的可行性，雖然存在含量微少等實(shí)際缺陷[9]，但仍為臨床診斷方案的具體實(shí)施提供了廣闊的前景。

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