丁 飛，謝裕安

原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率約為歐美地區(qū)的10倍，病死率位列我國惡性腫瘤第二位。因其起病隱匿，早期可無任何癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)病情已多為中、晚期，導(dǎo)致治療和預(yù)后均較差。我國原發(fā)性肝癌中，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占90%。目前已證實(shí)人群HBV/HCV感染、黃曲霉素毒B1(aflatoxin B1，AFB1)的攝入、飲水污染等與HCC的發(fā)生密切相關(guān)，而遺傳易患性導(dǎo)致的個(gè)體HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的不同也日益受到關(guān)注。

DNA分子作為遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)于維持機(jī)體的正常生理功能和遺傳穩(wěn)定性至關(guān)重要。如果細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)機(jī)制發(fā)生異常，將會(huì)導(dǎo)致個(gè)體的癌癥易患性顯著增加。XRCC1(X-ray cross complementing group 1)是一種重要的DNA修復(fù)基因，其編碼的蛋白質(zhì)在堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)和DNA單鏈斷裂修復(fù)的過程中起重要作用。因此，目前認(rèn)為XRCC1的多態(tài)性可能改變DNA修復(fù)的功能和效率，使環(huán)境因素致癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。目前對(duì)XRCC1的單核苷酸多態(tài)性研究最多的3個(gè)位點(diǎn)分別位于第6、9、10外顯子中，依次為C26304T、G27466A和G28152A，分別導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸殘基的改變(Arg194Trp、Arg280His和Arg194Trp)[1]。大量的臨床流行病學(xué)資料顯示，上述3個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與個(gè)體發(fā)生某些腫瘤的危險(xiǎn)性有關(guān)。其中，在對(duì)XRCC1基因多態(tài)性與HCC易患性的研究方面，大多集中在399位點(diǎn)，而對(duì)194位點(diǎn)的研究較少。因此，為進(jìn)一步探討XRCC1基因Arg194Trp多態(tài)性與HCC遺傳易患性之間的關(guān)系，本研究選取我國HCC高發(fā)地區(qū)之一的廣西扶綏縣HCC家系人群與當(dāng)?shù)卣＜蚁等巳哼M(jìn)行病例對(duì)照研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用病例對(duì)照研究方法，于2003年1月—2011年5月在廣西扶綏縣采集21個(gè)HCC家系(HCC家系組，76例)，于2011年1—5月在與HCC家系相同的自然村采集20個(gè)對(duì)照家系(對(duì)照組，76例)。HCC家系組年齡16～86歲，平均(45.6±14.8)歲；男42例，女34例；HBsAg陽性48例，HBsAg陰性28例；甲胎蛋白(AFP)陽性13例，陰性63例；吸煙(≥1包/d)6例，不吸煙(<1包/d)70例；飲酒(≥250 g/d)6例，不飲酒(<250 g/d)70例。對(duì)照組年齡16～85歲，平均(48.0±16.6)歲；男56例，女20例；HBsAg、AFP均陰性；吸煙34例，不吸煙42例；飲酒34例，不飲酒42例。HCC家系由HCC患者(A組，21例)及與其有血緣關(guān)系的直系親屬(B組，55例)共同組成，其中HCC患者為廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院進(jìn)行外科手術(shù)的扶綏縣患者，術(shù)后經(jīng)組織病理學(xué)診斷為HCC，術(shù)前未經(jīng)放射、化學(xué)或生物治療，且經(jīng)病史采集提示其直系親屬中至少已有1人確診HCC。對(duì)照家系(C組)與HCC家系無血緣關(guān)系，且其家庭結(jié)構(gòu)、成員數(shù)與HCC家系相似，體檢結(jié)果均正常，無肝炎病史、腫瘤病史、腫瘤家族史。

1.2 方法 本研究采取匹配設(shè)計(jì)，通過嚴(yán)格選擇受檢者，經(jīng)不同人員對(duì)具體信息進(jìn)行核實(shí)和檢查以及對(duì)潛在的混淆因素進(jìn)行校正來控制偏倚。然后檢測各組受檢者XRCC1 Arg194Trp基因型。

1.2.1 DNA提取 按照天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的試劑盒說明，從手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本或外周血標(biāo)本中提取XRCC1的基因組DNA。

1.2.2 XRCC1 Arg194Trp基因型分析 以限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR-RFLP)方法進(jìn)行XRCC1基因Arg194Trp多態(tài)性分析。參照文獻(xiàn)[2]設(shè)計(jì)引物序列：上游引物5′-GCCCCGTCCCAGGTA-3′，下游引物5′-AGCCCCAAGACCCTTTCACT-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系：1 μl模板DNA，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，加雙蒸水(ddH2O)到反應(yīng)體系為25 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、59 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸30 s(進(jìn)行30個(gè)循環(huán))，72 ℃最后延伸5 min。

RFLP酶切反應(yīng)體系：10×Buffer 1 μl、PCR產(chǎn)物6.5 μl、10 μg/μl小牛血清(BSA)0.1 μl、10 U/μl PvuⅡ內(nèi)切酶0.8 μl、滅菌去離子水1.6 μl，總反應(yīng)體系為10 μl。放入37 ℃恒溫儀溫育4 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，于Thermo熒光成像儀下觀察結(jié)果。同時(shí)，PCR產(chǎn)物送測序(上海英駿生物技術(shù)有限公司)。

結(jié)果判斷：XRCC1密碼子194位點(diǎn)存在野生型Arg和突變型Trp兩種等位基因，野生型純合子Arg/Arg(CC基因型)不能被限制性內(nèi)切酶PvuⅡ酶切，只有一個(gè)長491 bp的片段；突變型純合子Trp/Trp(TT基因型)能完全被限制性內(nèi)切酶PvuⅡ酶切，產(chǎn)生分別為197 bp和294 bp的兩個(gè)片段；突變型雜合子Arg/Trp(CT基因型)酶切后則產(chǎn)生分別為197、294、491 bp的3個(gè)片段。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律進(jìn)行吻合度檢驗(yàn)。采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)表示各種基因型與發(fā)生HCC風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性。OR值以非條件Logistic回歸法計(jì)算，所有統(tǒng)計(jì)采用雙側(cè)概率檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酶切結(jié)果 XRCC1基因Arg194Trp多態(tài)性的各基因型通過凝膠電泳分析鑒定并經(jīng)測序證實(shí)：圖1為Arg194Trp的PCR擴(kuò)增的目的片段(491 bp)；圖2為Arg194Trp的PCR產(chǎn)物的RFLP分析；圖3～5為不同基因型的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA測序分析結(jié)果。

注：M為Marker 2，1～10為PCR產(chǎn)物(491 bp)
圖1 XRCC1基因Arg194Trp PCR擴(kuò)增目的片段
Figure1 PCR amplification of XRCC1 gene C26304T site Arg194Trp

注：M為Marker DL2000，第2、5、12泳道為CT基因型，第4、6泳道為TT基因型，其他泳道均為CC基因型
圖2 XRCC1基因Arg194Trp PCR-RFLP分析
Figure2 Genotyping of XRCC1 gent C26304T site Arg194Trp polymorphism by PCR-RFLP analysis

圖3 XRCC1基因194位點(diǎn)DNA測序分析(CC基因型)Figure 3 DNA sequencing of XRCC1 gene site 194(CC genotype)

圖4 XRCC1基因194位點(diǎn)DNA測序分析(TT基因型)Figure 4 DNA sequencing of XRCC1 gene site 194(TT genotype)

圖5 XRCC1基因194位點(diǎn)DNA測序分析(CT基因型)Figure 5 DNA sequencing of XRCC1 gene site 194(CT genotype)

2.2 XRCC1基因194位點(diǎn)基因型吻合度檢驗(yàn) 經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，各組人群中XRCC1 Arg194Trp等位基因型頻率與期望值吻合度較好(A組：χ2=1.80，P=0.18；B組：χ2=1.51，P=0.22；C組：χ2=1.70，P=0.19)，符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡，表明具有良好的代表性。

2.3 XRCC1 Arg194Trp基因型分布及等位基因分布 3組受檢者中XRCC1基因194位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中A組基因型分布及等位基因頻率與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P<0.012 5(α′)，見表1〕。

2.4 XRCC1基因194位點(diǎn)基因多態(tài)性與HCC的關(guān)系 采用非條件Logistic回歸分析，對(duì)性別、年齡、吸煙和飲酒4個(gè)因素進(jìn)行校正，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B組CT、TT基因型個(gè)體發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)分別是CC基因型個(gè)體的0.473倍和0.426倍。C組CT、TT基因型個(gè)體發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)分別是CC基因型個(gè)體的0.206倍和0.240倍?？梢?，CT、TT基因型個(gè)體發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)可能較CC基因型個(gè)體減低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多細(xì)胞、多階段的過程，與個(gè)體遺傳和外部環(huán)境的作用關(guān)系密切。由于外部環(huán)境損傷機(jī)體主要是通過DNA發(fā)揮作用，因此，DNA損傷后是否能夠得到及時(shí)、準(zhǔn)確的修復(fù)對(duì)于防止細(xì)胞癌變至關(guān)重要。BER是DNA損傷后最主要的修復(fù)機(jī)制之一，涉及切除損傷堿基和核心BER反應(yīng)兩個(gè)重要過程，由多種蛋白參與，其中XRCC1起重要作用[3]。XRCC1自身不具有催化酶的活性，但其編碼的蛋白與DNA聚合酶β、DNA連接酶Ⅲ、多聚ADP核糖聚合酶(PARP)結(jié)合形成復(fù)合體，發(fā)揮重要的支架蛋白作用，參與BER和DNA單鏈斷裂修復(fù)[4-5]。目前研究已發(fā)現(xiàn)XRCC1基因的多態(tài)性與食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌等多種腫瘤的發(fā)生存在相關(guān)性，如Xing等[6]對(duì)XRCC1基因194位點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)攜帶TT基因型者比攜帶CC、CT基因型者發(fā)生鱗狀細(xì)胞食管癌的危險(xiǎn)性增加；Hung等[7]研究發(fā)現(xiàn)，CC基因型個(gè)體與肺癌風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性。在對(duì)XRCC1基因多態(tài)性與HCC易患性的研究方面，Kiran等[8]在印度人群中進(jìn)行的研究結(jié)果顯示，Arg194Trp、Arg280His基因多態(tài)性會(huì)增加患肝炎相關(guān)HCC的風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)Arg280His與Arg194Trp或Arg399Gln聯(lián)合作用時(shí)患肝炎相關(guān)HCC的風(fēng)險(xiǎn)將顯著提高。

本研究選取我國HCC高發(fā)地區(qū)之一的廣西扶綏縣HCC家系人群為研究對(duì)象。研究結(jié)果顯示，HCC家系中未患HCC者CT基因型個(gè)體發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型個(gè)體的0.473倍〔95%CI(0.117，1.914)〕；TT基因型個(gè)體發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型個(gè)體的0.426倍〔95%CI(0.064，2.858)〕。對(duì)照家系中CT基因型個(gè)體發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型的0.206倍〔95%CI(0.035，1.201)〕；TT基因型個(gè)體發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型個(gè)體的0.240倍〔95%CI(0.027，2.168)〕。無論是對(duì)照家系還是HCC家系人群中，CT基因型和TT基因型的個(gè)體較CC基因型發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故結(jié)果僅提示T等位基因可能會(huì)減低HCC的發(fā)生。

HCC的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，其中作為分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)的遺傳因素可以改變個(gè)體對(duì)環(huán)境中致HCC因素的易患性。對(duì)于XRCC1基因Arg194Trp多態(tài)在不同人群、不同地區(qū)的研究結(jié)果出現(xiàn)的分歧，可能與其遺傳背景、生活地域、習(xí)慣及環(huán)境中接觸的致癌物不同有關(guān)。

表1 3組受檢者中XRCC1 Arg194Trp基因型分布及等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 1 Comparison of genotype distribution and allele frequency of XRCC1 Arg194Trp

注：C組基因型與A組比較，χ2=12.091，P=0.002；C組等位基因頻率與A組比較，χ2=8.294，P=0.004

表2 XRCC1 Arg194Trp基因型與HCC患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系〔n(%)〕Table 2 Association between XRCC1 Arg194Trp genotype and HCC

注：ref代表參照，即以CC基因型作為參照；-無數(shù)據(jù)；*表示B組與A組比較，△表示C組與A組比較

綜上所述，本研究尚未發(fā)現(xiàn)XRCC1基因Arg194Trp多態(tài)性與HCC發(fā)病具有相關(guān)性，但提示CT基因型和TT基因型的個(gè)體患HCC的風(fēng)險(xiǎn)可能較CC基因型的個(gè)體減低。本研究未得到預(yù)期的陽性結(jié)果的主要原因，可能與收集到的樣本量不夠大有關(guān)。如果在今后的研究中加大HCC家系人群樣本量的收集，繼續(xù)上述研究可能會(huì)得到預(yù)期的陽性結(jié)果。另外，本研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步研究扶綏縣乃至其他地區(qū)HCC高危人群的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提供了分子遺傳學(xué)的依據(jù)，并對(duì)HCC的預(yù)防具有一定的參考意義。

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