劉 冉,邸 麗,李 江,郝洪軍,高 楓,孫 葳,黃一寧△

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100034；2.北京宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 100053)

丹紅注射液是一種用于治療腦梗死的中成藥復(fù)方制劑，已有臨床試驗證實其可改善腦梗死后神經(jīng)功能缺損程度[1,2]，但其作用機制尚未完全闡明。內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)是一種具有增殖分化潛能的血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，正常情況下多儲存于骨髓內(nèi)，而腦缺血等應(yīng)激狀態(tài)下可動員至外周循環(huán)參與缺血組織的修復(fù)與再生[3，4]。增加腦缺血后EPCs數(shù)目或增強其修復(fù)能力，有可能作為新的作用靶點成為腦梗死治療的研究方向之一。本研究擬通過大鼠腦梗死模型觀察丹紅注射液對腦梗死后EPCs數(shù)量及對神經(jīng)功能缺損的影響，研究丹紅注射液的作用機制。

1 材料與方法

1．1 動物與分組

清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(280±20) g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。實驗動物按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、對照組和丹紅治療組，每組各20只。

1.2 實驗方法

術(shù)前1 h經(jīng)尾靜脈抽血后，對照組及丹紅治療組采用線栓法制作大腦中動脈梗死模型。術(shù)后6 h治療組按照2ml/kg給予丹紅濃縮注射液腹腔注射，對照組給予2 ml/kg生理鹽水腹腔注射，間隔24 h 1次，連續(xù)5 d。在手術(shù)后24 h±2 h、72 h±2 h、168 h±2 h經(jīng)尾靜脈采血，用流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)CD133+/VEGFR-2+雙陽性細(xì)胞的百分率，并進行神經(jīng)功能缺損評分。

1.3 線栓法制作永久性大腦中動脈栓塞(permanent Middle cerebral artery occlusion，p-MCAO)模型5

頸部正中切口，游離左側(cè)肩胛舌骨肌結(jié)扎并剪斷。仔細(xì)分離迷走神經(jīng)，充分游離左側(cè)頸總動脈、頸總動脈分叉處和頸外動脈起始端。結(jié)扎頸外動脈起始端和頸總動脈近心端，動脈夾暫時夾閉總動脈分叉處，并在動脈夾近心端打一松結(jié)備用，在頸總動脈結(jié)扎線遠(yuǎn)心端剪一小口將線栓送入，并將線結(jié)適當(dāng)打緊以防出血。松開動脈夾，送線至距頸總動脈分叉處(18±0.5) mm， 稍感阻力時停止，最后將線結(jié)打緊固定線栓位置。用青霉素沖洗創(chuàng)口并逐層縫合，待動物清醒后放回籠中，自由攝食水。術(shù)中保持呼吸道通暢，使用60 W白熾燈高度為37 cm直接照射，保持肛溫37℃。假手術(shù)組僅暴露頸部血管，不進行動脈結(jié)扎及放置線栓，其余步驟同對照組。

1.4 神經(jīng)功能缺損評分

大鼠術(shù)后2 h及24 h±2 h、72 h±2 h、168 h±2 h由另一實驗者在不告知分組的情況下進行神經(jīng)功能評分。大鼠MCAO后神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn)(參照 Zea Longa 法6)：0：沒有明顯神經(jīng)功能保障體征；1：對側(cè)前肢不能完全伸展(輕度局灶神經(jīng)功能障礙)；2：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈(中度局灶神經(jīng)功能障礙)；3：向?qū)?cè)傾倒(重度局灶神經(jīng)功能障礙)；4：不能自行活動，意識障礙。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測內(nèi)皮祖細(xì)胞計數(shù)

靜脈血100 μL加入兔抗人CD133單克隆IgG抗體(Abcam公司，ab16518)和小鼠抗人VEGFR-2單克隆抗體(Sigma公司，B0555)，采用美國BECKMAN COULTER公司EPICS-XL流式細(xì)胞儀，以Cell Quest軟件進行流式細(xì)胞分析。在前向角散射光和側(cè)向角散射光雙參數(shù)點圖上對單個核細(xì)胞群設(shè)窗，收集細(xì)胞500000個，以此群統(tǒng)計CD133+/VEGFR-2+細(xì)胞的百分率。所有操作人員均經(jīng)過培訓(xùn)合格后方可上崗。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，等級資料及計量資料均采用中位數(shù)(最小值，最大值)進行描述，2組計量指標(biāo)比較采用2個獨立樣本的秩和檢驗，所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分

對照組及丹紅治療組造模大鼠在完全清醒后均出現(xiàn)左側(cè)Horner 征和右側(cè)前肢為主的偏癱，表現(xiàn)為右側(cè)前肢屈曲、向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，無動物出現(xiàn)意識障礙。

表1顯示，丹紅治療組大鼠腦梗死后2 h神經(jīng)功能缺損評分2(1、2)；梗死后24 h神經(jīng)功能缺損評分2(1、4)；梗死后72 h神經(jīng)功能缺損評分1(0、4)；梗死后168 h神經(jīng)功能缺損評分0(0、1)。丹紅治療組梗死后24～48 h死亡2只，梗死后第96～120 h、第120～144小時、第144～168小時各死亡1只。

對照組大鼠腦梗死后2 h神經(jīng)功能缺損評分2(1、2)，梗死后24 h神經(jīng)功能缺損評分2.5(0、4)，梗死后72 h神經(jīng)功能缺損評分2(0、4)，梗死后168 h神經(jīng)功能缺損評分3(0、4)。對照組梗死后24～48 h死亡5只，48～72 h死亡4只，術(shù)后第72～96小時及第96～120小時各死亡2只。假手術(shù)組大鼠各時間點神經(jīng)功能缺損評分均為0。

表1 丹紅治療組及對照組大鼠神經(jīng)功能缺損評分

2.2 丹紅治療組、對照組及假手術(shù)組各時間點外周血CD133+/VEGFR-2+雙陽性細(xì)胞數(shù)百分率

表2顯示，丹紅治療組、對照組及假手術(shù)組MCAO術(shù)前、術(shù)后24 h、術(shù)后72 h和術(shù)后168 h內(nèi)皮祖細(xì)胞百分率，3組術(shù)前EPCs數(shù)量百分率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

與對照組比較，丹紅治療組大鼠腦梗死后24 h、72 h及168 h EPC數(shù)量百分率顯著升高(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。與假手術(shù)組比較，丹紅治療組術(shù)后24 h、72 h外周血EPCs數(shù)量顯著升高(P<0.01，P<0.01)，2組術(shù)后168 h比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.610)。

假手術(shù)組與對照組術(shù)后24 h和術(shù)后72 h2組外周血EPC數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.839，P=0.804)；術(shù)后168 h對照組外周血EPC數(shù)量比假手術(shù)組顯著降低(P=0.001)。

3 討論

EPCs是一種位于骨髓內(nèi)具有增殖分化潛能的內(nèi)皮前體細(xì)胞，腦缺血所致的血管內(nèi)皮功能受損以及炎性細(xì)胞和一些集落刺激因子可誘導(dǎo)EPCs動員進入外周血并歸巢到損傷部位，通過促進血管新生，改善局部適宜神經(jīng)再生的微環(huán)境，分泌某些細(xì)胞因子如腦源性營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor BDNF)刺激神經(jīng)干細(xì)胞再生，并提高神經(jīng)元的功能[8～13]等機制參與損傷組織的修復(fù)重建，改善神經(jīng)系統(tǒng)功能[12,14]。Moubarik等報道，腦梗死后經(jīng)靜脈注射移植的EPCs可遷移到缺血區(qū)域，促進神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)[15,16]。但目前EPCs移植受分離培養(yǎng)、手術(shù)條件及倫理學(xué)限制較大，距臨床應(yīng)用仍有一定距離。國內(nèi)已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，EPCs能夠改善外周缺血組織的供血[17,18]，但專門針對缺血性腦卒中的研究尚少[19,20]。以上研究結(jié)果提示，EPC能夠改善腦梗死后神經(jīng)功能缺損，如能利用藥物干預(yù)的方法誘導(dǎo)其EPCs動員的生理性高峰前移，或者促進其向損傷部位遷移，就有可能在一定程度上達(dá)到類似外源性補充EPCs的效果，更有效地修復(fù)損傷組織，改善神經(jīng)元功能及預(yù)后，這種方法在臨床上簡便易行，也更易為患者接受。因此，本研究試圖觀察丹紅注射液對腦梗死后EPCs數(shù)量及功能的影響，如取得肯定效果，將對腦缺血的治療理念產(chǎn)生重大影響。內(nèi)皮祖細(xì)胞的判定方法目前仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，通過流式細(xì)胞儀根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志抗原直接從外周血中進行細(xì)胞檢測，因其敏感、精確、可重復(fù)性好，是目前普遍采用的方法[21]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)，選用CD133+ / VEGFR-2+ 雙陽性作為判定內(nèi)皮祖細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。其中CD133是個跨膜蛋白，在人骨髓、胎肝和外周血的造血干細(xì)胞上均有表達(dá)，也表達(dá)于EPCs，且不表達(dá)于成熟內(nèi)皮細(xì)胞。KDR/VEGFR-2也是前體細(xì)胞的早期標(biāo)志。

表2 丹紅治療組、對照組和假手術(shù)組各時間點CD133+/VEGFR-2+雙陽性細(xì)胞數(shù)百分率 (%)

本研究顯示，對照組外周血EPCs高峰在72 h內(nèi)均不明顯，7 d時甚至有所下降，提示生理狀態(tài)下腦梗死后EPCs動員水平較低，遠(yuǎn)不足以完成神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)，因此可能導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)細(xì)胞損傷，甚至出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，這同時也解釋了對照組大鼠在梗死早期死亡率高于丹紅治療組的原因。而丹紅治療組大鼠腦梗死后不僅存活率顯著升高，外周血EPCs數(shù)量亦顯著高于對照組；即使術(shù)后7 d丹紅治療組EPCs數(shù)量均有所下降，但仍顯著高于對照組。上述結(jié)果說明，丹紅注射液無論在腦缺血早期還是晚期均能顯著增加外周血EPCs數(shù)量，但這種促進作用有隨時間延長而減弱的趨勢，提示其作用主要局限于早期，對晚期再生修復(fù)功能改善有限。比較神經(jīng)功能評分發(fā)現(xiàn)，丹紅治療組評分從術(shù)后24 h開始即低于對照組，且一直持續(xù)到術(shù)后168 h，但由于樣本量較小，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，還需進一步研究以驗證丹紅注射液對腦梗死大鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能的作用。

丹紅注射液由丹參、紅花2味藥組成，丹參和紅花為中醫(yī)經(jīng)典活血化瘀植物藥，二藥合用起到活血化瘀、通脈舒絡(luò)的作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹紅注射液包含丹參酮、丹參酚酸、紅花黃色素等主要成分，上述成分綜合作用可有效預(yù)防或減輕腦缺血再灌注損傷。已有研究發(fā)現(xiàn)，丹紅改善循環(huán)的機制可能為內(nèi)皮祖細(xì)胞在腦缺血后的修復(fù)作用再生提供適合的血管微環(huán)境，從而改善神經(jīng)功能。也有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF具有能夠增加腦梗死后內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和改善神經(jīng)功能的作用，丹紅是通過這條通路間接增加內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量，或是通過其他機制正在研究中。

本研究的局限性是只觀察了丹紅注射液增加外周血EPCs數(shù)目的作用，未能明確其對EPCs歸巢、分化等功能狀態(tài)的影響，無法證實EPCs數(shù)目增加與改善神經(jīng)功能缺損的因果關(guān)系，無法從功能上證實其作用，還需進一步的實驗結(jié)果來闡明。

[1] 王搠.丹紅治療對急性腦梗死大鼠運動功能改善的影響[J]．臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志， 2010，9(16):1204-1205.

[2] 彭麗虹，盛春雷，余正.丹紅注射液治療缺血性腦卒中隨機對照試驗的系統(tǒng)評價[J]．中國執(zhí)業(yè)藥師，2010，7(8):3-11．

[3] Asahara T, Murohara T, Sullivan A et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J]. Science， 1997，275:964-967．

[4] Zhang ZG, Zhang L, Jiang Q, et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells participate in cerebral neovascularization after focal cerebral ischemia in the adult mouse[J]. Circ Res， 2002，90:284-288．

[5] Ginsberg MD, Busto R. Rodent models of cerebral ischemia[J]. Stroke， 1989，20:1627-1642．

[6] Zea Longa WL,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20:84-91.

[7] 鄧芬，胡長林，謝運蘭，丹紅注射液治療大鼠急性腦梗死的實驗研究[J]．中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2007，5:421-422.

[8] guchi A,Soma T,Tanaka H,et al.Administration of CD34+ cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesis in a mouse model.J.Clin[J]. Invest，2004，114:330-338.

[9] Jin K ,Zhu Y,SunY,et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) stimulates neurogenesis in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad[J]. Sci. U.S.A， 2002，99:11946-11950.

[10] Zhang R L,Zhang Z G,Chopp M,Neurogesis in the adult ischemic brain:generation,migration,survival,and restorative therapy[J].Neuroscientist，2005，11:408-416．

[11] Majka M,Janowska-Wieczorek A,Ratajczak J,et al.Numerous growth factors,cytokines,and chemokines are secreted by human CD34(+) cells,myeloblasts,erythroblasts,and megakaryoblasts and regulate normal hematopoiesis in an autocrine/paracrine manner[J].Blood，2001，97，3075-3085.

[12] Shen Q,Goderie S K,jin L,et al.Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells[J].Science，2004，304:1338-1340.

[13] Ward N L,Lamanna J C.The neurovascular unit and its growth factors:coordinated response in the vascular and nervous systems.Neurol[J].Res，2004，26:870-883.

[14] Leventhal C,Rafii S ,Rafii D,et al.Endothelial trophic support of neuronal production and recruitment from the adult mammalian subependyma.Mol[J].Cell Neurosci，1999，13:450-464.

[15] Moubarik C, Guillet B, Youssef B, et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke[J]. Stem Cell Rev and Rep， 2011，7:208-220.

[16] Lin YC, Ko TL, Shih YH, et al. Human umbilical mesenchymal stem cells promote recovery after ischemic stroke[J]. Stroke， 2011，42:2045-2053．

[17] 劉麗，張建寧．內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特征及其在疾病研究中的意義[J]．中華醫(yī)學(xué)雜志，2007，7:501-504．

[18] 易成剛，郭樹忠，張琳西．血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子基因轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮祖細(xì)胞移植促進缺血皮瓣存活的實驗研究[J]．中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，7:473-478．

[19] 徐寒松，雷閩湘，劉澤灝．黃芪對人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響[J]．中醫(yī)雜志，2008，49:160-162．

[20] 高冬，吳立婭，焦雨歡．血府逐瘀湯動員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響因素分析[J]．中醫(yī)雜志，2010，51：457-459．

[21] Khan SS, Solomon MA, McCoy JP,et al. Detection of circulating endothelial cells and endothelial progenitor cells by flow cytometry[J]. Cytometry B Clin Cytom， 2005，64:1-8．