楊宇峰，齊艷文，徐 娜，石 巖△

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032；2.遼寧電力中心醫(yī)院，沈陽 110016)

代謝組學(xué)(metabolic syndrome，MS)主要通過系統(tǒng)研究生命體在新陳代謝動態(tài)過程中代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，從而揭示機(jī)體生命活動代謝的本質(zhì)[1]。代謝組學(xué)是中醫(yī)證理論研究的重要方法，利用代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)中醫(yī)病證的關(guān)鍵生物標(biāo)記物，可促進(jìn)“證”本質(zhì)研究和中醫(yī)辨證的科學(xué)化和定量化，深層次理解中醫(yī)證候的本質(zhì)[2]。

本課題擬通過復(fù)制脾虛證代謝綜合征大鼠模型，對模型血漿標(biāo)本進(jìn)行代謝組學(xué)檢測，尋找脾虛證代謝綜合征病變的特征性代謝產(chǎn)物，并觀察代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系，探尋脾虛證代謝綜合征病變的分子機(jī)制，從而揭示脾虛證代謝綜合征中醫(yī)證候本質(zhì)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠20只，體質(zhì)量(180±20)g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供(動物合格證號SCXK(遼)2004-0018)。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d，自由飲水，無不良反應(yīng)、進(jìn)食、飲水和活動正常者納入實(shí)驗(yàn)。大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組和模型組，每組10只。

1.2 材料與試劑

乙腈(HPLC)、甲醇(HPLC)購自MERK公司(USA)，甲酸購自TEDIA公司(USA)，其他試劑均為市售分析純。

1.3 主要儀器設(shè)備

超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)；超低溫冰箱(MDF-U53V，三洋)；TG16-WS臺式高速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 造模方法

通過勞倦加飲食不節(jié)法造模[3]，同時(shí)制定脾氣虛證和代謝綜合征動物模型評估標(biāo)準(zhǔn)[3]，符合標(biāo)準(zhǔn)診斷者為造模成功，成模大鼠6只，成模率為60%。

2.2 樣本采集

2組動物取材前12 h禁食不禁水，按2 ml/kg體質(zhì)量腹腔注射8%異戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，分離血清，-80℃保存。

2.3 樣本制備

向100 μL樣本中加入400 μL色譜級甲醇∶乙腈=1∶1，Vortex 2 min后于4℃放置10 min，4℃15000 rpm離心15 min，取上清液400 μL，4℃15000 rpm離心10 min，取200 μl上清液進(jìn)行LC-MS全譜檢測。

2.4 UPLC/Q-TOF-MS分析

將UPLC/Q-TOF-MS獲得的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarkerLynx 軟件包，進(jìn)行峰識別、峰對齊和基線矯正等前處理，最后輸出三維矩陣，即由精確質(zhì)核比與保留時(shí)間組成的變量、樣品名稱和峰強(qiáng)度/面積。將處理后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-P11.5軟件分別進(jìn)行主成分分析(PCA)，偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)。

3 結(jié)果

3.1 原始色譜圖檢測

圖1顯示，對所有質(zhì)控樣本(quality control,QC)的總離子流色譜圖(total ion current chromatogram，TIC)進(jìn)行檢查，未發(fā)現(xiàn)含有異常TIC的樣本。QC樣本均勻分散在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，說明系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，數(shù)據(jù)可靠性良好。

圖1 正離子模式下QC樣品的UPLC Q-TOF MS總離子流(TIC)重現(xiàn)性比較

3.2 主成分分析(PCA)

3.3 偏最小二乘方-判別分析(PLS-DA)

圖2～圖4顯示，在PLS-DA處理下，模型組與空白組得到很好的分離。結(jié)果顯示，模型在ESI+模式下，R2X=0.452，R2Y=0.999，Q2=0.857，即其中45.2%的變量被作為用來塑造模型的主要成分，99.9%的樣本符合模型判別，模型的預(yù)測能力為85.7%。

圖2 ESI+模式下脾氣虛證代謝綜合征大鼠 血樣代謝PCA分析Scores圖注：PC=2，R2X=0.389，Q2=-0.023 GroupA=空白組；GroupC=模型組

圖3 ESI+模式下脾氣虛證代謝綜合征大鼠 血樣代謝PLS-DA分析Scores圖二維圖注：Scores plot of PLS-DA of group A Vs group C (ESI+) PC number=3，R2X=0.456，R2Y=0.997， Q2=0.835GroupA=空白組；GroupC=模型組

圖4 ESI+模式下脾氣虛證代謝綜合征大鼠 血樣代謝PLS-DA分析loading圖

3.4 尋找差異性代謝物

表1顯示，本實(shí)驗(yàn)采用PLS-DA模型第一主成分的VIP(Variable Importance in the Projection)值(閾值>1)，并結(jié)合t檢驗(yàn)的P值(閾值0.05)來尋找差異性表達(dá)代謝物。差異性代謝物的定性方法為，根據(jù)精確分子量搜索Metlin和HMDB數(shù)據(jù)庫，搜索質(zhì)量閾值設(shè)定為25ppm。鑒定出9個(gè)生物標(biāo)志物，9種代謝物在模型組中含量增加，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

通過實(shí)驗(yàn)研究，找到一些與脾氣虛證代謝綜合征大鼠模型相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物，而這些物質(zhì)正是體內(nèi)糖類、脂類、蛋白質(zhì)等代謝紊亂的結(jié)果。其中，N-乙?；?D-葡萄糖胺是葡萄糖在代謝過程中形成6-磷酸果糖經(jīng)谷氨酰胺6-磷酸果糖?；D(zhuǎn)移酶(GFAT)作用下生成的，這個(gè)過程也稱為己糖胺合成通路(HBP)。HBP是機(jī)體正常的葡萄糖代謝途徑之一，其流量因細(xì)胞外葡萄糖水平過高而增加，被認(rèn)為是機(jī)體的能量感受器，與胰島素抵抗、高血糖、高脂血癥和高胰島素血癥等密切相關(guān)[4]。絲氨酸屬于非必需氨基酸，具有許多重要的生理功能和作用。研究發(fā)現(xiàn)[5]，高胰島素和高糖誘導(dǎo)胰島素抵抗的分子機(jī)制可能與削弱細(xì)胞內(nèi)胰島素信號蛋白絲氨酸磷酸化以及進(jìn)一步的胰島素信號傳遞，從而抑制糖的轉(zhuǎn)運(yùn)活動有關(guān)。溶血磷脂酰膽堿能激活蛋白激酶 C，通過 Ca2+依賴或 Ca2+非依賴途徑導(dǎo)致血管平滑肌收縮，同時(shí)抑制內(nèi)皮衍生一氧化氮、血管內(nèi)皮超極化因子的釋放或使其失活，影響內(nèi)皮依賴性舒張作用，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性收縮[6]。還可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖，損害血管內(nèi)皮組織的連續(xù)性，促進(jìn)血管炎癥反應(yīng)并影響血小板聚集及血栓形成的過程。

表1 潛在生物標(biāo)志物鑒定結(jié)果

脾氣虛證代謝綜合征的發(fā)生與糖類、脂類、蛋白質(zhì)代謝紊亂有關(guān)，這些體內(nèi)的小分子內(nèi)源性代謝物可能是代謝綜合征中醫(yī)證候的物質(zhì)基礎(chǔ)。這些發(fā)生改變的代謝物可作為脾虛證代謝綜合征的生物標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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