孫 萌，劉 穎，王克林，孫 剛，王笑紅，翟志光，孫佩珠，王 健△

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700； 2.中國中醫(yī)科學(xué)院艾滋病防治研究中心，北京 100700)

人類γ δ-T淋巴細(xì)胞在外周血中的比例較小，大約占人外周血T淋巴細(xì)胞總量的3%左右，且主要表達(dá)Vγ2Vδ2 T淋巴細(xì)胞受體，75%的該受體基因發(fā)生過Vγ2-Jγ1/2鏈(TCR-)基因重排[1]。γ δ-T淋巴細(xì)胞主要分布在機(jī)體黏膜局部, 因而被視為機(jī)體受到抗原刺激后首先發(fā)生應(yīng)答的一線防御細(xì)胞。由于γ δ-T與α β-T 淋巴細(xì)胞比較，具有在感染后能夠更迅速增殖、能調(diào)節(jié)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞功能、不需要抗原提呈直接識(shí)別抗原等能力，因此γδ-T細(xì)胞在機(jī)體黏膜免疫抗病毒和抗腫瘤方面發(fā)揮著不可忽視的作用[2]。

理論上講，機(jī)體未受任何抗原刺激，其γ δ-T細(xì)胞受體(TCR-鏈)基因的重排是隨機(jī)的，表現(xiàn)為多家族和多克隆性，而當(dāng)其受到腫瘤病毒抗原等相應(yīng)抗原刺激后，γ δ-T細(xì)胞受體(TCR-鏈)基因譜系會(huì)呈現(xiàn)寡克隆優(yōu)勢(shì)并出現(xiàn)克隆性改變。目前對(duì)HIV感染者γ δ-T細(xì)胞受體(TCR-鏈)多態(tài)性較完整的研究尚少見報(bào)道。本研究運(yùn)用多重引物PCR片段熒光分析技術(shù)，對(duì)HIV/AIDS患者的γ δ-T細(xì)胞受體(TCR-鏈)進(jìn)行了基因重排分子測(cè)定，為中醫(yī)藥治療免疫系統(tǒng)紊亂和缺陷疾病的療效評(píng)價(jià)提供一種新的方法手段。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

健康人群來自中國中醫(yī)科學(xué)院研究生院學(xué)生，陽性被試人群來自北京市地壇醫(yī)院跟蹤隨訪的HIV/AIDS患者，全部由地壇醫(yī)院蛋白印記試驗(yàn)確認(rèn)為HIV抗體陽性。HIV/AIDS患者分類按照美國疾病預(yù)防控制中心修訂的HIV感染分類與CD4+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)分期方法，每毫升血液CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)小于200為AIDS患者。篩選后確定3組被試人群，其中包括10名健康人，20名HIV感染者以及10名AIDS患者。

1.2 全血DNA提取

清晨采靜脈血外周血2 ml, 將真空采血管內(nèi)血樣混勻，取300 ul抗凝全血，采用Promega 公司的Maxwell 16 Blood DNA Purificanfion Kit自動(dòng)提取全血DNA系統(tǒng)。檢測(cè)蛋白含量符合熒光PCR要求，OD 260/280值在1.8～2.0之間。

1.3 γ δ-T細(xì)胞受體TCR-基因熒光PCR 反應(yīng)

1.3.1 PCR引物 圖1顯示，引物由上海生工生物工程公司合成，TCR-基因重排的檢測(cè)需要進(jìn)行2管PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，其中TCR-鏈基因重排的檢測(cè)PCR引物設(shè)計(jì)。

圖1 TCR-鏈PCR引物設(shè)計(jì)示意圖

圖2 健康人群組γδ-T細(xì)胞受體(TCR-鏈)基因譜型掃描分析圖(包括A、B兩管PCR產(chǎn)物分析圖)注：X軸為熒光PCR 產(chǎn)物片斷大小，Y軸不同高度的峰相對(duì)應(yīng)熒光PCR產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度

TCR-γ: A管: 正向引物：Vγf1(-178) 5′-GGAAGGCCCCACAGCRTCTT-3′； Vγ10(-126) 5′-AGCATGGGTAAGACAAGCAA-3′。 反向引物：Jγ1.1/2.1：3′-CGAGTATCATTGAAGCGGACCATT-5′-HEX * (+64)；Jγ1.3/2.3 3′-GAGAAACCGTCACCTTGTTGTG-5′-HEX * (+38)。

TCR-γ：B管: 正向引物：Vγ9(-141) 5′-CGGCACTGTCAGAAAGGAATC-3′；Vγ11(-58) 5′-CTTCCACTTCCACTTTGAAA-3′。反向引物：Jγ1.1/2.1：3′-CGAGTATCATTGAAGCGGACCATT-5′-HEX* (+64)；Jγ1.3/2.3 3′-GAGAAACCGTCACCTTGTTGTG-5′-HEX * (+38)。

1.3.2 PCR反應(yīng)體系和條件 采用Promega的T-Easy PCR 試劑盒，其中 TCR-鏈基因重排總反應(yīng)體系均為20 ul，分別加入工作反應(yīng)物，確保20 ul 的PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為96℃變性 10 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。

1.3.3 上機(jī)檢測(cè) 采用ABI-3100 基因片斷分析儀進(jìn)行熒光多重PCR產(chǎn)物的片段分析。熒光PCR產(chǎn)物經(jīng)ABI-3100 基因片斷分析儀分析，并通過GeneMarker V1.95軟件掃描分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用TCR Assay1.0 定量分析軟件計(jì)算正常人個(gè)體TCR-受體鏈基因PCR產(chǎn)物分別多樣性D值(產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)差與均值之百分比)，D值可以定量表示TCR多樣性變化以及離散情況。計(jì)算健康人群和與HIV/AIDS 患者γ δ-T細(xì)胞受體(TCR-鏈)基因分布的均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及與均值比率表示離散距離D(Distance)值。應(yīng)用Microsoft Excel 2003 (Microsoft) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖；健康人群與HIV/AIDS患者組間離散距離D(Distance)值比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)是否小于每毫升全血350個(gè)為分組標(biāo)準(zhǔn)，將HIV/AIDS患者分為2組進(jìn)行比較，CD4+T細(xì)胞數(shù)與T淋巴細(xì)胞TCR-受體基因多樣性變化的相關(guān)分析為Pearson 積差相關(guān)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康人群與HIV/AIDS患者γ δ-T細(xì)胞受體(TCR-鏈)基因熒光PCR產(chǎn)物掃描分析

圖3 HIV感染者γδ-T細(xì)胞受體(TCR-鏈)基因譜型掃描分析圖(包括A、B兩管PCR產(chǎn)物分析圖)注：X軸為熒光PCR 產(chǎn)物片斷大小，Y軸不同高度的峰相對(duì)應(yīng)熒光PCR產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度

圖4 AIDS患者γδ-T細(xì)胞TCR-鏈?zhǔn)荏w基因譜型掃描分析圖(包括A、B兩管PCR產(chǎn)物分析圖)注：X軸為熒光PCR 產(chǎn)物片斷大小，Y軸不同高度的峰相對(duì)應(yīng)熒光PCR產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度

2.2 健康人群與HIV感染者γδ-T細(xì)胞受體(TCR-鏈)基因重排多樣性比較

表1顯示，健康人群與HIV感染者比較結(jié)果顯示，HIV感染者與AIDS患者的平均D值顯著高于健康人群(P<0.05)，說明健康人群 TCR-受體鏈基因PCR產(chǎn)物離散性較小，更接近正態(tài)分布特征；而HIV感染者與AIDS患者之間，TCR-受體鏈基因PCR產(chǎn)物離散度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明HIV感染者和AIDS患者組TCR-受體鏈基因PCR產(chǎn)物多樣性變化比較大，離散性也比較大。同時(shí)以CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)是否小于每毫升全血350個(gè)為分組標(biāo)準(zhǔn)，將HIV/AIDS患者分為2組進(jìn)行比較，盡管2組感染者之間的CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)有顯著差異，但2組T淋巴細(xì)胞TCR-受體鏈基因PCR產(chǎn)物離散度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且HIV/AIDS患者CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)與TCR-受體鏈基因PCR產(chǎn)物離散度呈負(fù)相關(guān)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 健康人群與HIV/AIDS患者γ δ-T細(xì)胞受體

(TCR-鏈)基因片斷多樣性比較

表1 健康人群與HIV/AIDS患者γ δ-T細(xì)胞受體

A管PCR產(chǎn)物離散度D值(%)B管PCR產(chǎn)物離散度D值(%)健康人群10.5±3.63.8±1.5HIV感染者18.6±4.8*6.6±3.9*AIDS患者21.6±5.3*10.2±3.3*

注：與健康人群比較：*P<0.05

3 討論

近年來，γ δ-T細(xì)胞在HIV病毒早期感染中的損傷逐漸得到關(guān)注，有數(shù)據(jù)支持γ δ-T細(xì)胞可以作為HIV病毒感染及疾病發(fā)展進(jìn)程的標(biāo)志免疫細(xì)胞[3]。盡管γ δ-T細(xì)胞沒有CD4受體，HIV病毒并不直接感染損害γ δ-T細(xì)胞，但γ δ-T細(xì)胞可以作為HIV病毒感染及疾病發(fā)展進(jìn)程的標(biāo)志免疫細(xì)胞，γ δ-T細(xì)胞對(duì)調(diào)節(jié)HIV感染者黏膜免疫感染至關(guān)重要。國外研究顯示，為期2年的高效抗病毒治療(highly active antiretroviral therapy,HAART) 能夠降低HIV感染者體內(nèi)的病毒載量以及提升CD4+T細(xì)胞數(shù)，但并不能有效地恢復(fù)γ δ-T細(xì)胞的功能和數(shù)量[4]。未經(jīng)HAART治療的長(zhǎng)期不進(jìn)展者(natural viral suppressors，NVSs)體內(nèi)γ δ-T細(xì)胞的數(shù)量和功能卻能保持正常的水平[5]。從這個(gè)角度來看，直接作用調(diào)節(jié)人體消化道黏膜系統(tǒng)的中草藥，是否對(duì)HIV感染者體內(nèi)γ δ-T細(xì)胞的功能恢復(fù)有所幫助值得研究。

正常人在沒有外來抗原特異性刺激的情況下，機(jī)體γ δ-T細(xì)胞受體(TCR-鏈)基因片斷處于隨機(jī)重排狀態(tài)，形成了γ δ-T細(xì)胞受體多克隆性，其TCR-鏈基因片斷掃描圖類似“鐘型”的高斯分布。健康人群γ δ-T細(xì)胞受體完整的多樣性可以保障機(jī)體具有識(shí)別外界多樣性抗原的潛能。若機(jī)體免疫系統(tǒng)處于激活狀況，如外界病毒性感染激活和淋巴細(xì)胞瘤患者免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)動(dòng)員激活狀態(tài)，T淋巴細(xì)胞受體TCR基因會(huì)出現(xiàn)單一化重組表達(dá)，其表面標(biāo)志物受體基因的多樣性出現(xiàn)損害，進(jìn)而導(dǎo)致其他病原體機(jī)會(huì)感染的增加[6]。目前針對(duì)HIV病毒感染導(dǎo)致γδ-T細(xì)胞受體基因多樣性的研究較少。本研究顯示，HIV/AIDS患者體內(nèi)γ δ-T細(xì)胞受體TCR-鏈基因呈現(xiàn)單一化重組表達(dá)，其表面標(biāo)志物受體基因的多樣性出現(xiàn)損害。

本研究還比較了不同水平CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)HIV/AIDS患者γδ-T細(xì)胞受體基因多樣性情況，發(fā)現(xiàn)HIV/AIDS患者CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)與其γ δ-T細(xì)胞受體基因多樣性之間有一定的相關(guān)性。但相關(guān)性不顯著，因?yàn)楸狙芯恐皇窃谝粋€(gè)時(shí)間點(diǎn)橫斷面采集被試人群的資料和數(shù)據(jù)，還需要進(jìn)行長(zhǎng)期的縱向跟蹤研究才能得到更加全面的信息數(shù)據(jù)。

目前HIV/AIDS患者免疫系統(tǒng)重建的研究工作逐漸引起重視，但臨床上評(píng)價(jià)中醫(yī)藥治療HIV/AIDS患者療效及其免疫系統(tǒng)功能的指標(biāo)仍主要依據(jù)CD4+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和病毒載量，存在很大的局限性，也是亟待研究解決的問題之一。因?yàn)镃D4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)僅代表CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，不能完全反映整體免疫系統(tǒng)的功能，特別是早期HIV感染者黏膜免疫系統(tǒng)的功能。最近的研究表明，黏膜免疫系統(tǒng)在HIV感染以及AIDS病理發(fā)展過程中扮演了重要角色，大多數(shù)HIV感染是通過黏膜傳染的，并且在HIV/AIDS整個(gè)感染發(fā)病過程中，感染者的黏膜免疫系統(tǒng)都存在損傷缺陷[7]。廣泛的研究表明，HIV病毒對(duì)消化道黏膜免疫系統(tǒng)的破壞、炎性細(xì)胞因子以及長(zhǎng)期的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，HAART藥物都會(huì)使HIV感染者黏膜免疫系統(tǒng)處于激活狀態(tài)[8-9]。

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