謝文英，尚立芝△,張良芝,常學(xué)輝,胡文豪

(1．河南中醫(yī)學(xué)院，鄭州 450008; 2．河南省中醫(yī)院，鄭州 450008)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonarydisease,COPD)是常見的以氣道不完全可逆性阻塞為特征的慢性炎癥性疾病，由多種炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)參與所致。其患病率隨年齡的增長而增加，是中國人群的主要致死病因之一[1]。COPD 主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、咳痰等呼吸道癥狀，屬于中醫(yī)“咳嗽”、“痰飲”、“喘證”等范疇。本課題組自擬愛羅咳喘寧方，經(jīng)多年臨床和前期動物實驗顯示，愛羅咳喘寧能顯著提高COPD患者和動物模型的肺功能，改善肺組織結(jié)構(gòu)，但其作用機(jī)制不明[2～7]。本研究制備脂多糖(LPS) 加煙霧誘導(dǎo)COPD大鼠模型，觀察愛羅咳喘寧對COPD大鼠BALF 和血漿中參與炎癥反應(yīng)的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白細(xì)胞介素-8 (interleukin-1，IL-8 ) 和IL-18及炎細(xì)胞的影響，探討愛羅咳喘寧對COPD的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與動物

愛羅咳喘寧方藥物組成:炙麻黃6 g,苦杏仁10 g,茯苓15 g,半夏10 g,葶藶子10 g,蒼術(shù)10 g,干姜6 g,麥芽20 g,白術(shù)12 g,山藥15 g,黨參15 g,芫花6 g等,以上藥物由河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑室制成口服液,真空包裝,每支100 ml,含生藥100 g。6月齡雄性清潔級SD大鼠50只，體質(zhì)量300±20 g，由河南省實驗動物中心提供(HNLA-2010-111)。

1.2 試劑與儀器

檢測大鼠TNF-α(H052)、IL-8(H008)和IL-18(H015) ELISA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。自制動物熏箱(50 cm×50 cm×40 cm)、18號靜脈套管針(馬來西亞制造)、脂多糖(LPS，Sigma 公司)、紅旗渠牌香煙(烤煙型,焦油含量14 mg/支,尼古丁含量1.1 mg/支，河南安陽卷煙廠)。FA/JA電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、TGL-16GA低溫高速離心機(jī)(上海安亭儀器廠)、VIS-7220型分光光度儀(北京第二光學(xué)儀器廠)、U-CMAD3型OLYMPUS顯微鏡(日本Olympus公司)、FAME16/30F全自動酶標(biāo)議(瑞士哈美頓公司)等。

2 方法

2.1 動物分組與模型制備

大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、愛羅咳喘寧口服液低、中、高劑量組(5，10，20 mL·kg-1·d-1)，每組10只。參照文獻(xiàn)[8,9]制備脂多糖(LPS) 煙霧誘導(dǎo)COPD大鼠模型。采用氣管注LPS加熏香煙方法：在第1天和第14天用1%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉，仰臥位固定于大鼠固定板，暴露聲門，將18號靜脈套管針快速插入氣管，拔出針芯，用1 mL注射器注入溶于生理鹽水的LPS200 μL(1 mg/mL)，然后將大鼠固定板直立旋轉(zhuǎn)，使LPS能夠均勻分布于兩肺。第2～28天(第14天除外)將大鼠置入熏箱內(nèi)熏香煙煙霧40 min/次，每天2次(每次8支煙)，每周休息1 d；正常組第1天、第14天經(jīng)氣管注入200 μL生理鹽水，其余無特殊處理。

2.2 給藥方案

模型制備成功后，參考文獻(xiàn)[10]正常組、模型組灌胃給予蒸餾水(10 mL·kg-1·d-1)，各治療組大鼠給予愛羅咳喘寧口服液低、中、高劑量組分別灌胃混懸液(5、10、20 mL·kg-1·d-1，每毫升含愛羅咳喘寧口服液生藥0.75 g，連續(xù)7 d。

2.3 取材、標(biāo)本制作與檢測

[11,12]和試劑盒說明書進(jìn)行操作，ELISA法用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠血漿和BALF 中TNF-α、IL-8和IL-18濃度。

2.3.1 血漿TNF-α、IL-8和 IL-18 第7天給藥結(jié)束后，10%水合氯醛(0. 3 ml/100 g) 腹腔麻醉，剖腹抽取腹主動脈血，離心取血清放入-20℃冰箱內(nèi)待測。

2.3.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)的制備、炎細(xì)胞計數(shù)及分類 采血后斷頭處死大鼠，開胸暴露氣管和肺門，結(jié)扎右主支氣管。用套管針穿刺至左肺，以生理鹽水2 ml×3次行肺泡灌洗，回收率約80%，BALF存入硅塑管內(nèi)靜置1 h。原液行細(xì)胞計數(shù)后，取1 mlBALF以2000 r/min離心5 min，取上清液置入EP管，保存于-20 ℃ 冰箱中待檢。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠BALF中炎細(xì)胞計數(shù)和分類比較

表1顯示，與正常組比較，模型組BALF中炎細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)均顯著增高(均P< 0.01)。與模型組比較，愛羅咳喘寧低、中、高劑量組BALF中炎細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05或P<0.01)。

3.2 愛羅咳喘寧對COPD大鼠血漿TNF-α、IL-8和IL-18 含量的影響

表2顯示，與正常對照組比較，模型組血漿TNF-α、IL-8和IL-18含量均顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，愛羅咳喘寧口服液中劑量組TNF-α、IL-8和IL-18含量均顯著降低(均P<0.05)。

3.3 愛羅咳喘寧對COPD大鼠 BALF中TNF-α、IL-8和IL-18含量的影響

表3顯示，模型組 BALF 中TNF-α、IL-8和IL-18都顯著高于正常組(均P<0.05)；與模型組比較，愛羅咳喘寧低、中、高劑量組中TNF-α、IL-8和IL-18都顯著降低(均P<0.05)。

表1 各組COPD大鼠BALF中炎癥細(xì)胞計數(shù)和分類比較

注：與模型組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；N-中性粒細(xì)胞，M-巨噬細(xì)胞

表2 愛羅咳喘寧對各組COPD大鼠血漿IL-8、TNF-α含量的影響

注：與模型組比較:1)P<0.05，2)P<0.01(下表同)

表3 愛羅咳喘寧各組COPD大鼠 BALF 中 IL-8 和 TNF-α 含量的影響

3.4 COPD模型組大鼠血漿和BALF 中TNF-α、IL-8和IL-18含量的相關(guān)性

應(yīng)用非參數(shù)Spearman等級相關(guān)分析, 對TNF-α與IL-8含量的相關(guān)性進(jìn)行分析, 結(jié)果顯示，在模型組中血漿TNF-α與IL-8呈正相關(guān)(rs=0.631,P=0.010)， BALF 中TNF-α與IL-8含量亦呈正相關(guān)(rs=0.783,P=0.000)。

4 討論

COPD的發(fā)病機(jī)制目前不清。研究表明，吸入有害物質(zhì)引起氣道與肺的持續(xù)炎癥是COPD發(fā)病的關(guān)鍵。在COPD患者的氣道、肺實質(zhì)和肺血管中均存在著巨噬細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞增加，導(dǎo)致肺實質(zhì)破壞，引起氣道狹窄。本研究結(jié)果顯示，模型組BALF中炎細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)均顯著高于正常組(均P<0.01)，與文獻(xiàn)報道相近[13]，提示中性粒細(xì)胞的支氣管肺組織浸潤起重要作用。與模型組比較，愛羅咳喘寧低、中、高劑量組BALF中炎細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)顯著低于模型組(P<0.05或P<0.01)，提示愛羅咳喘寧通過抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)增加起抗炎作用。

COPD氣道與肺實質(zhì)的持續(xù)炎癥涉及炎癥細(xì)胞及其釋放的炎癥介質(zhì)。煙霧中的粉塵、細(xì)菌等進(jìn)入氣道，刺激呼吸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)，TNF-α升高是COPD病情加重的一個重要指標(biāo)，它可使IL-8轉(zhuǎn)錄因子NF-kB激活。香煙煙霧中的顆粒物質(zhì)被巨噬細(xì)胞吞噬后，促進(jìn)TNF-α、IL-8和IL-18的釋放[14]。IL-8起炎癥促進(jìn)作用，并刺激中性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮，滲出并釋放中性粒細(xì)胞酶如蛋白酶、彈性酶等溶解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而炎細(xì)胞浸潤，誘發(fā)炎癥反應(yīng)和肺組織損傷[15]。

COPD的臨床表現(xiàn)屬于中醫(yī)“咳嗽”、“痰飲”、“喘證”等范疇，中醫(yī)認(rèn)為其病因病機(jī)為六淫之邪侵襲入體，衛(wèi)表受邪，肺失肅降，痰濁滋生，或他邪犯肺，或他臟腑累及于肺。本病其標(biāo)在肺，其本在脾、腎。愛羅咳喘寧為自擬方藥，由炙麻黃、苦杏仁、云苓、蒼術(shù)、半夏、葶藶子、干姜、麥芽、白術(shù)、山藥、黨參、芫花、赤芍等藥物組成。方中炙麻黃辛散而微兼苦降之性，可使肺氣宣暢，以復(fù)肺司肅降、平喘之要藥，配伍杏仁祛痰止咳平喘，兩者同為君藥；臣以半夏燥濕化痰，葶藶子瀉肺降氣、祛痰平喘；干姜溫肺化飲，茯苓健脾化痰，芫花瀉水逐飲、祛痰止咳；佐以黨參健脾益肺，白術(shù)健脾益氣，山藥補(bǔ)脾、養(yǎng)肺、固腎、益精，蒼術(shù)燥濕健脾，麥芽健脾和胃，赤芍活血祛瘀，全方可起健脾祛痰、止咳平喘之效[4，5]。

本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組血漿和BALF中TNF-α、IL-8和IL-18水平均顯著增高，提示TNF-α、IL-8和IL-18共同參與 COPD 炎癥反應(yīng)。與模型組比較，愛羅咳喘寧中劑量組大鼠血漿和BALF 中 IL-8、IL-18與TNF-α水平顯著低于模型組(均P<0.05)，提示愛羅咳喘寧可減低血漿和 BALF 中 TNF-α、IL-8、IL-18 水平，具有抑制 TNF-α、IL-8和IL-18合成與釋放，從而發(fā)揮其抗炎作用，可能是愛羅咳喘寧口服液治療COPD的作用機(jī)制之一。

參考文獻(xiàn)：

[1] 鐘南山.慢性阻塞性肺疾病在中國[J].中國實用內(nèi)科雜志, 2011, 31 (5 ):321-322.

[2] 謝文英,景曉平.愛羅咳喘口服液治療支氣管哮喘42例[J].中國中醫(yī)藥信息雜志, 2005,12(2):82-83.

[3] 謝文英,常學(xué)輝,張良芝. 愛羅咳喘寧湯治療咳嗽變異性哮喘30例[J].中醫(yī)研究, 2007,20(5):35-37.

[4] 謝文英,常學(xué)輝,張良芝. 愛羅咳喘寧口服液對支氣管哮喘患者白細(xì)胞介素2及白細(xì)胞介素13的影響[J].中醫(yī)雜志,2007,48(7):614-615.

[5] 謝文英,常學(xué)輝,張良芝. 愛蘿咳喘寧口服液治療急性支氣管哮喘50例療效觀察[J].新中醫(yī),2007,39(2):48-49.

[6] 謝文英,常學(xué)輝,張良芝. 愛羅咳喘寧方對支氣管哮喘患者IL-4、IL-5影響的臨床研究[J].新中醫(yī),2008,40(7):40-41.

[7] 謝文英,張良芝,劉霖,等. 愛羅咳喘寧口服液對慢性支氣管炎大鼠白細(xì)胞介素-13 和腫瘤壞死因子-α含量的影響[J].中國新藥雜志,2012,21 (5 ):551-554.

[8] Mahadeva R, Shapiro S D. Chronic obstructive pulmonary disease:experimental animal models of pulmonary emphysema[J].Thorax,2002, 57: 908-914.

[9] 宋小蓮,王昌惠,白沖.脂多糖結(jié)合熏煙法和單純熏煙法建立慢性阻塞性肺病大鼠模型的比較[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2010,31(3):246-249.

[10] 宋一平,崔德健,茅培英,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及藥物干預(yù)的影響[J].中華內(nèi)科雜志, 2000, 39: 556-557.

[11] 王付,尚立芝,苗小玲,等. 四逆散加味對肝纖維化大鼠肝功能、肝纖維化指標(biāo)及病理變化的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志, 2012,18(5):177-180.

[12] 尚立芝,王付,苗小玲,等.四逆散加味抗大鼠肝纖維化作用機(jī)制[J].中國實驗方劑學(xué)雜志, 2012,18(18 ):194-197.

[13] Angshu B,Terence A R Seemungal,Raymond J Sapsford,et al.Relation of sputum inflammatory markers to symptoms and lung function changes in COPD exacerbations[J]. Thorax,2000,55:11-120.

[14] Wedzicha,J A.Mechanisms of exacerbations[J].Novartis Found Symp,2001,234:84-103.

[15] CrulT, SpruitMA, eta.lMarkers of inflammation and disuse in vastus lateralis of chronic obstructive pulmonary disease patients[J].European journal of clinical investigation, 2007, 11(37): 897-904.