徐林敏，張 充，陸兆新，別小妹，趙海珍，呂鳳霞

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

γ-氨基丁酸產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化

徐林敏，張 充，陸兆新，別小妹，趙海珍，呂鳳霞*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

采用紙層析法對(duì)南京地區(qū)多個(gè)不同場(chǎng)所采集的土樣進(jìn)行了菌種分離純化，篩選到一株產(chǎn)γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的菌株X-1，經(jīng)形態(tài)特征與16S rDNA序列分析鑒定為巨大芽孢桿菌。通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基成分為葡萄糖30.0 g/L、蛋白胨30.0 g/L、K2HPO40.6 g/L、磷酸吡哆醇0.3 g/L、L-谷氨酸鈉10.0 g/L、NaNO33.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L。在此條件下，GABA濃度可達(dá)21.57 mmol/L，比優(yōu)化前GABA濃度提高了3.83 倍。

γ-氨基丁酸；篩選；培養(yǎng)基優(yōu)化

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA，也稱氨酪酸）廣泛分布于動(dòng)植物中，是人和動(dòng)植物體中一種非常重要的非蛋白質(zhì)氨基酸。GABA不僅是動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有效的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，有鎮(zhèn)靜、降血壓、抗驚厥、癲癇、增進(jìn)腦活力、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌、保肝利腎等生理作用[1-6]，還在非神經(jīng)的組織中發(fā)揮激素或營(yíng)養(yǎng)因子的功能，對(duì)動(dòng)物機(jī)體正常的生理功能起著重要的調(diào)節(jié)作用[7-8]，因而其在功能性食品及醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。2009年，GABA被批準(zhǔn)為新資源食品，目前GABA在食品工業(yè)中已廣泛地應(yīng)用于飲料、乳制品、烘焙食品等制品中[9-10]。

生物合成GABA的關(guān)鍵酶是谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD），其催化L-谷氨酸的α-脫羧反應(yīng)，生成GABA。該酶在低等生物 和高等生物中都可發(fā)現(xiàn)。微生物因其生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單、發(fā)酵成本低等特點(diǎn)。因此，利用微生物中的GAD催化谷氨酸生產(chǎn)GABA，不受資源、環(huán)境和空間的限制，相對(duì)于復(fù)雜的植物富集和存在安全性問題的化學(xué)合成，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)[11]。

目前已在多種微生物中發(fā)現(xiàn)了GAD的存在，如大腸桿菌、乳酸菌、酵母菌、霉菌等[12]，但這些微生物的GAD活力普遍不高，且為胞內(nèi)酶，GAD的提取純化困難，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。尤其，大腸桿菌發(fā)酵后會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，存在安全性問題[13]。芽孢桿菌作為一種新的有潛在藥用價(jià)值化合物的產(chǎn)生菌[14]，自1971年首次報(bào)道產(chǎn)GABA以來，研究甚少。本實(shí)驗(yàn)從土壤中篩選高產(chǎn)GABA的芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，并采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，旨在探討影響芽孢桿菌產(chǎn)γ-氨基丁酸的諸因素，以提高GABA的濃度，為今后工業(yè)化生產(chǎn)GABA提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

樣品采集于土壤，采樣于江蘇省南京市紫金山、南京郊區(qū)奶廠和南京生態(tài)果園。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L（切片水煮30 min，過濾取汁），葡萄糖20 g/L，pH值自然，115 ℃、30 min滅菌備用，固體培養(yǎng)基另加15.0～20.0 g/L的瓊脂。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30.0 g/L、酵母浸膏1.0 g/L、NaNO33.0 g/L、K2HPO41.0 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、L-谷氨酸鈉5.0 g/L，調(diào)節(jié)pH值至6.0，于115 ℃、30 min滅菌備用。

1.1.3 試劑

γ-氨基丁酸（含量≥9 9%）、磷酸吡哆醛（pyrodoxal-5-phosphate，PLP） 美國(guó)Sigma公司；L-谷氨酸鈉（L-monosodium glutamate，L-MSG，含量≥99%） 江蘇菊花味精集團(tuán)有限公司；甲醇、四氫呋喃、丙酮（均為色譜純） 美國(guó)Tedia公司；丹磺酰氯（dansyl chloride，DNS-Cl） Flukahcemei公司；細(xì)菌總DNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)試劑，水為自制超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100 Series高效液相色譜（VWD檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent公司；EUTECH pH510酸度計(jì)美國(guó)Eutech公司；Centrifuge 5804R冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；HT6029超凈工作臺(tái) 蘇州進(jìn)化設(shè)備有限公司；BL-220H電子精密天平 日本島津公司；PTC-100TM PCR儀 美國(guó)MJ Research公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種篩選

稱取10 g采集的樣品，放入盛有100 mL生理鹽水和玻璃珠的250 mL三角瓶中，于30 ℃、180 r/min培養(yǎng)30 min。將樣品用滅菌生理鹽水進(jìn)行遞度稀釋涂布于PDA固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)72 h。挑取單菌落接入含5.0 g/L L-谷氨酸鈉的發(fā)酵液中按30 ℃、180 r/min進(jìn)行搖瓶發(fā)酵72 h。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 定性檢測(cè)

采用紙層析法。展開劑：V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3，內(nèi)含質(zhì)量濃度為4 mg/mL的水合茚三酮。以γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，取發(fā)酵液上清液5 μL進(jìn)行點(diǎn)樣，層析3.5 h后將濾紙放于85 ℃烘箱中顯色5 min，觀察是否有GABA斑點(diǎn)。

1.3.2.2 定量分析

采用高效液相色譜法。將離心后的發(fā)酵上清液用0.2 mol/L（pH 9.8）的NaHCO3緩沖液稀100 倍，然后取20 μL，加入等量的（4 g/L）DNS-Cl丙酮溶液，置37 ℃條件下避光衍生化反應(yīng)，用Agilent 5 HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速0.6 mL/min，254 nm檢測(cè)。流動(dòng)相A為甲醇、B為乙酸鈉緩沖液，梯度洗脫。洗脫時(shí)，流動(dòng)相B的比例為：0～8 min，20%；8～25 min，20%～50%；26～34 min維持100%；35～50 min，返回20%[15]。

1.3.3 菌株鑒定

1.3.3.1 形態(tài)特征鑒定

按照參考文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。

1.3.3.2 16S rDNA的擴(kuò)增與測(cè)序

采用細(xì)菌總DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物F1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物R1：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應(yīng)體系（總體積50 μL）：10×PCR緩沖液5 μL；正、反向引物F1、R1 均為10 mmol/L各2.5 μL；dNTP（10 mmol/L）4 μL；基因組DNA1.0 μL；TaqDNA聚合酶0.5 μL；雙蒸水34.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸3 min，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物測(cè)序由南京金思瑞生物技術(shù)公司完成。

1.3.3.3 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

將16S rDNA序列與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析。選擇同源性較高及已報(bào)道產(chǎn)GAD的細(xì)菌16S rDNA核苷酸序列，利用Clustalx2.0進(jìn)行多重聯(lián)配，然后再利用MEGA5.0軟件采用鄰接（Neighbour-Joining）方法以E.coli O157∶H7為外群（out-group）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行Bootstrap分析。

1.3.4 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

1.3.4.1 不同碳源對(duì)GABA發(fā)酵的影響

分別以30.0 g/L的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作為碳源作進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵液中GABA濃度，從而篩選出最佳的碳源。

1.3.4.2 碳源質(zhì)量濃度對(duì)GABA發(fā)酵的影響

分別向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 g/L的葡萄糖，30 ℃、180 r/min搖瓶發(fā)酵72 h，測(cè)發(fā)酵液中GABA濃度，確定合適的葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.3.4.3 不同氮源對(duì)GABA發(fā)酵的影響

分別向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10.0 g/L的牛肉膏、蛋白胨、玉米浸膏、黃豆粉和酵母浸膏，篩選有機(jī)氮源。再以篩出的有機(jī)氮源與3.0 g/L NaNO3、尿素、磷酸氫二銨、硫酸銨分別組成復(fù)合氮源，測(cè)定發(fā)酵液中GABA濃度，確定最佳的氮源組成。

1.3.4.4 氮源質(zhì)量濃度對(duì)GABA發(fā)酵的影響

分別向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 g/L的蛋白胨，30 ℃、180 r/min搖瓶發(fā)酵72 h，測(cè)發(fā)酵液中GABA濃度，確定合適的蛋白胨質(zhì)量濃度。再以最佳蛋白胨質(zhì)量濃度為基礎(chǔ)，別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L的NaNO3，30 ℃、180 r/min搖瓶發(fā)酵72 h，測(cè)發(fā)酵液中GABA濃度，確定合適的NaNO3質(zhì)量濃度。

1.3.4.5 L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)GABA發(fā)酵的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 g/L的L-谷氨酸鈉，確定最適的底物質(zhì)量濃度。

1.3.4.6 無機(jī)鹽及生長(zhǎng)因子對(duì)GABA發(fā)酵的影響

選取K2HPO4、MgSO4、CaCl2、生物素和PLP，分別在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中按不同質(zhì)量濃度添加，確定最佳無機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子。

1.3.4.7 正交試驗(yàn)優(yōu)化

經(jīng)單因素試驗(yàn)，篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4、PLP和L-MSG 5 種物質(zhì)，設(shè)定五因素三水平試驗(yàn)，確定最佳培養(yǎng)基成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 GAD產(chǎn)生菌的篩選

2.1.1 初篩

從南京市紫金山、南京郊區(qū)奶廠和南京生態(tài)果園的土壤中分離出487 株菌，對(duì)這些菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，篩選出3 株有茚三酮顯色斑點(diǎn)，菌株編號(hào)為X-1、X-2、X-3，結(jié)果見圖1。

圖1 發(fā)酵液紙層析圖Fig.1 Paper chromatography of the fermented broth

2.1.2 復(fù)篩

圖2 GABA標(biāo)品（a）及發(fā)酵液（b）的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of GABA standard (a) and the fermented broth (b)

采用高效液相色譜法對(duì)有顯色斑點(diǎn)的菌株進(jìn)行復(fù)篩，以確定待測(cè)菌株發(fā)酵液中GABA濃度。HPLC譜圖如圖2所示。以峰面積（y）對(duì)GABA質(zhì)量濃度（x）作線性回歸，制作GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線，GABA質(zhì)量濃度在0～5 g/L內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=871.55x+314.16（R2=0.998 6）。GABA的定量分析結(jié)果見表1。其中菌株X-2的發(fā)酵液中GABA濃度最高，達(dá)（17.19±0.09）mmol/L，但經(jīng)驗(yàn)證X-2為革蘭氏陰性菌、無芽孢，故不再進(jìn)行后續(xù)研究。而菌株X-1為芽孢桿菌，其發(fā)酵液中GABA的濃度為4.46 mmol/L，選取該菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 GABA產(chǎn)生菌篩選結(jié)果Table1 Screening of GABA-producing strains

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌株X-1形態(tài)特征

在PDA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，菌株X-1菌體短橢圓狀，染色均勻、革蘭氏染色陽(yáng)性，芽孢近端生、圓形。初步判斷菌株X-1屬于芽孢桿菌屬。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株X-1的16S rDNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，測(cè)序核苷酸序列為1 080 bp，GenBank登記號(hào)為NR074290。經(jīng)與GenBank+EMBL+D DBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的16S rDNA核苷酸序列比對(duì)，結(jié)果顯示菌株X-1的16S rDNA核苷酸序列與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）的16S rDNA核苷酸序列的同源性最高，達(dá)到99%。構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹 如圖3所示，菌株X-1的16S rDNA與已知的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）聚在一個(gè)分支上，相似性為100%。

結(jié)合X-1的形態(tài)特征和16S rDNA序列分析，菌株X-1鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

圖3 以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA

2.3 B. megaterium X-1生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線

對(duì)B. megaterium X-1進(jìn)行搖瓶振蕩培養(yǎng)，測(cè)定菌體OD600nm和發(fā)酵液中GABA濃度隨時(shí)間的變化情況，結(jié)果如圖4所示。B. megaterium X-1在2 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)到12 h時(shí)菌體生長(zhǎng)達(dá)到最高，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，而GABA在發(fā)酵24 h后才開始產(chǎn)生，這可能是由于GABA的產(chǎn)生與巨大芽孢桿菌芽孢的形成有關(guān)[17]。

圖4 B. megaterium X-1的生長(zhǎng)曲線及GAB A濃度Fig.4 Growth curve and GAB A production of B. megaterium X-1

由圖4可知，當(dāng)菌體進(jìn)入穩(wěn)定期后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，GABA濃度逐漸提高，這種類型的合成方式在酶生物合成的模式中屬于滯后合成型，該類酶所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性較好，可以在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后相 當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行酶的生物合成。考慮到隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，生產(chǎn)周期也延長(zhǎng)，生產(chǎn)成本增加，所以確定72 h為B. megaterium X-1產(chǎn)GABA的發(fā)酵時(shí)間。

2.4 培養(yǎng)基組分優(yōu)化

2.4.1 不同碳源對(duì)GABA發(fā)酵的影響

圖5 碳源對(duì)B. megaterium X-1產(chǎn)-氨基丁酸的影響Fig.5 E ffect of carbon sources on the production of GABA

不同碳源對(duì)B. megaterium X-1產(chǎn)GABA濃度影響，結(jié)果如圖5所示，添加葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、蔗糖5 種碳源中，葡萄糖在提高發(fā)酵液中GABA濃度最顯著，GABA濃度為4.46 mmol/L。因此，選擇葡萄糖為培養(yǎng)基的碳源。

2.4.2 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)GABA發(fā)酵的影響

圖6 不同質(zhì)量濃度葡萄糖對(duì)B. megaterium X-1產(chǎn)-氨基丁酸濃度的影響Fig.6 Effe ct of glucose concentration on the production of GABA

由圖6可知，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度為30.0 g/L時(shí)，發(fā)酵 液中GABA濃度最高，為4.46 mmol/L。但隨著葡萄糖添加量提高，GABA濃度逐漸降低。因此選擇葡萄糖的添加量為30.0 g/L。

2.4.3 不同氮源對(duì)GABA發(fā)酵的影響

圖7 不同氮源對(duì)B. megaterium X-1產(chǎn)-氨基丁酸濃度的影響Fig.7 Effect of nitrogen sources on the production of GABA

圖8 不同復(fù)合氮源對(duì)B. megaterium X-1產(chǎn)-氨基丁酸濃度的影響Fig.8 E ffect of mixed nitrogen sources on the the production of GABA

不同氮源對(duì)B. megaterium X-1產(chǎn)GABA濃度影響，結(jié)果如圖7所示。在單一氮源的實(shí)驗(yàn)中，蛋白胨作為唯一氮源時(shí)GABA濃度最高，為3.15 mmol/L。這也與Sun Baishen等[18]研究相一致。而在培養(yǎng)基中加入3.0 g/L NaNO3、尿素、磷酸氫二銨、硫酸銨組成復(fù)合氮源時(shí)，結(jié)果如圖8所示，NaNO3與蛋白胨組成復(fù)合氮源時(shí)，GABA濃度最高，為4.68 mmol/L。其他無機(jī)氮源效果不明顯，故培養(yǎng)基選用蛋白胨與NaNO3組成復(fù)合氮源。

2.4.4 氮源質(zhì)量濃度對(duì)GABA發(fā)酵的影響

圖9 不同質(zhì)量濃度蛋白胨對(duì)B. megaterium X-1產(chǎn)-氨基丁酸濃度的影響Fig.9 Effect of peptone concentration on the production of GABA

由圖9可知，當(dāng)培養(yǎng)基中蛋白胨質(zhì)量濃度為30.0 g/L時(shí)，發(fā)酵液中GABA濃度最高，為6.60 mmol/L。隨著蛋白胨添加量增加，GABA濃度逐漸降低。 因此選擇蛋白胨添加量為30.0 g/L。

圖 10 不同質(zhì)量濃度NaNO3對(duì)B. megaterium X-1產(chǎn)y-氨基丁酸濃度的影響Fig.10 Effect of NaNO3concentration on the production of GABA

以30.0 g/L葡萄糖為碳源，30.0 g/L的蛋白胨為有機(jī)氮源，探討不同質(zhì)量濃度的NaNO3對(duì)B. megaterium X-1發(fā)酵產(chǎn)GABA的影響如圖10所示，NaNO3質(zhì)量濃度為3.0 g/L效果最好，為7.53 mmol/L。當(dāng)NaNO3質(zhì)量濃度在1.0～2.0 g/L時(shí)，發(fā)酵液中GABA濃度逐漸增加，當(dāng)NaNO3質(zhì)量濃度在3.0～5.0 g/L時(shí)，GABA濃度逐漸下降。這可能是由于NaNO3作為速效氮源，在發(fā)酵過程中適量的NaNO3有利于菌體快速利用氮源，達(dá)到較高的生物量。但過多的NaNO3對(duì)于細(xì)菌的生長(zhǎng)及GABA的產(chǎn)生有一定的抑制作用，且NaNO3在作用過程中對(duì)GABA濃度的影響不明顯，故不將其考慮在正交試驗(yàn)中。

2.4.5 L-谷氨酸鈉對(duì)GABA發(fā)酵的影響

L-谷氨酸鈉在發(fā)酵過程中既是GABA生成的底物，又可為菌體生長(zhǎng)提供氮源[19]。不同質(zhì)量濃度L-谷氨酸鈉的添加對(duì)發(fā)酵液中GABA濃度影響，如圖11所示。當(dāng)L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度在5.0～10.0 g/L時(shí)，發(fā)酵液中GABA濃度逐漸增加，當(dāng)L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為10.0 g/L時(shí)，發(fā)酵液中GABA濃度最高，為7.55 mmol/L。當(dāng)L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度高于10.0 g/L時(shí)，GABA濃度有所下降，說明L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)GABA濃度影響明顯。

圖 11 不同質(zhì)量濃度L-谷氨酸鈉對(duì)B. megaterriiuumm X-1產(chǎn)γ-氨基丁酸濃度的影響Fig.11 Effect of monosodium glutamate concentration on the production of GABA

2.4.6 無機(jī)鹽及生長(zhǎng)因子對(duì)GABA發(fā)酵的影響

圖 12 無機(jī)鹽（a）及生長(zhǎng)因子（b）對(duì)B. megateriiuumm X-1產(chǎn)γ--氨基丁酸濃度的影響Fig.12 Effect of inorganic salts (a) and growth factors (b) on the the production of GABA

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入0～1.2 g/L的K2HPO4、MgSO4、CaCl2與0.1～0.5 g/L的生物素和PLP，探討無機(jī)鹽對(duì)B. megaterium X-1發(fā)酵產(chǎn)γ-氨 基丁酸的影響，結(jié)果如圖12所示，MgSO4、CaCl2和生物素對(duì)GABA濃度的提高效果不明顯，而K2HPO4和PLP在一定質(zhì)量濃度下能明顯提高發(fā)酵液中GABA濃度，這與孟和畢力格[20]、Komatsuzaki[21]等的研究成果一致，故將K2HPO4和PLP作為正交試驗(yàn)的兩個(gè)因素進(jìn)行后續(xù)討論。

2.4.7 正交試驗(yàn)優(yōu)化

通過單因素試驗(yàn)，篩選葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4、L-MSG和PLP 5 個(gè)主要影響因素，采用三水平五因素L16（35）正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果及分析如表2、3所示。

表2 培養(yǎng)基組分的正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table2 Orthogonal array design with experimental results

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table3 Analysis of variance (ANOVA) of the experimental results from orthogonal array design

從表2、3可以反映出各因素對(duì)發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量的影響主次順序是B＞A＞E＞C＞D，即培養(yǎng)基中蛋白胨對(duì)GABA濃度影響最顯著，葡萄糖、PLP和KH2PO4次之，L-MSG添加量沒有顯著性影響。由表2可知，5 個(gè)因素的最佳組合為A2B2C2D1E3。確定B. megaterium X-1最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分為A2B2C2D1E3，即葡萄糖30.0 g/L、蛋白胨30.0 g/L、KH2PO40.6 g/L、L-MSG 10.0 g/L、PLP 0.3 g/L、NaNO33.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L。在此條件下重復(fù)發(fā)酵3 次，GABA濃度可達(dá)（21.57±1.23） mmol/L，比優(yōu)化前（4.46 mmol/L）提高3.83 倍。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)從土壤中分離出一株產(chǎn)GABA的芽孢桿菌菌株X-1，經(jīng)形態(tài)特征與16S rDNA鑒定為巨大芽孢桿菌（B. megaterium）。1976年Foerster等[22]研究發(fā)現(xiàn)在B. megaterium芽孢休眠過程中不存在GABA，當(dāng)芽孢開始萌發(fā)后，GABA含量開始增加，表明GAD與芽孢的萌發(fā)有關(guān)，而本研究 B. megaterium X-1在發(fā)酵12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，芽孢開始萌發(fā)，發(fā)酵液中GABA濃度開始增加，并隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，GABA濃度持續(xù)增加。這與Foerster等[22]的研究相一致，而與楊勝遠(yuǎn)等[23]研究的B. megaterium EJC-1培養(yǎng)6 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，40 h后進(jìn)入穩(wěn)定 期，50 h后進(jìn)入衰亡期而有所不同，說明不同來源的菌種其生產(chǎn)周期和培養(yǎng)特性有所不同。

雖然早在1971年就已發(fā)現(xiàn)B. megaterium中存在GAD，但有關(guān)B. megaterium產(chǎn)GABA發(fā)酵工藝的研究也未見報(bào)道。本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)B. megaterium X-1的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，確定了B. megaterium X-1最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分。在此條件下，發(fā)酵液中GABA濃度可達(dá)21.57 mmol/L，比優(yōu)化前提高了3.83 倍，優(yōu)化效果十分明顯。同時(shí)，在B. megaterium X-1的培養(yǎng)基優(yōu)化研究過程中也發(fā)現(xiàn)，PLP作為GAD的 輔酶，對(duì)提高B. megaterium X-1發(fā)酵產(chǎn)GABA濃度效果顯著，這與Coda等[24]的研究結(jié)果類似，究其原因可能PLP作為GAD的輔酶，與酶蛋白結(jié)合而增強(qiáng)GAD活性，從而提高發(fā)酵液中GABA濃度。但考慮其成本較高，且對(duì)光、O2較為敏感，有待進(jìn)一步探討PLP成分的替代品。

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Screening of Gamma-Aminobutyric Acid-Producing Bacterium and Medium Optimization

XU Lin-min, ZHANG Chong, LU Zhao-xin, BIE Xiao-mei, ZHAO Hai-zhen, Lü Feng-xia*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

A γ-aminobutyric acid (GABA)-producing strain X-1 was isolated from soil samples by paper chromatography. Based on morphological characteristics, and 16S rDNA sequence and phylogenic analyses, X-1 was identified as Bacillus megaterium. The culture medium of Bacillus megaterium X-1 was studied by single factor and orthogonal array designs. The optimal medium components were 30.0 g/L glucose, 30.0 g/L peptone, 0.6 g/L K2HPO4, 0.3 g/L pyrodoxal-5-phosphate, 10.0 g/L monosodium glutamate, 3.0 g/L NaNO3, 0.5 g/L MgSO47H2O, and 0.01 g/L FeSO47H2O. Using the optimized medium, the highest GABA yield of 21.57 mmol/L was obtained, representing a 4.83-fold increase over that before optimization.

γ-aminobutyric acid; screening; culture medium optimization

Q939.9

A

1002-6630（2014）23-0238-07

10.7506/spkx1002-6630-201423046

2014-09-03

徐林敏（1990—），女，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：2012108004@njau.edu.cn

*通信作者：呂鳳霞（1963—），女，教授，博士，主要從事酶工程研究。E-mail：lufengxia@njau.edu.cn