余 帆，徐彤彤，佐 妍，呂祥威

糖尿病作為臨床上一種常見(jiàn)的慢性代謝性疾病，其發(fā)病率已隨著人們生活水平的提高而逐年增加。糖尿病常伴發(fā)或并發(fā)各種心血管疾病，譬如心肌缺血、心肌梗死及猝死[1-2]。這一高危因素，已逐漸引起學(xué)者重視。近年來(lái)瘦素與胰島素抵抗(insulin resistance,IR)在心血管疾病中的作用備受關(guān)注[3-4]，目前國(guó)內(nèi)就兩者在糖尿病并發(fā)心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemic reperfusion injury,MIRI)過(guò)程中的相關(guān)作用報(bào)道較少。本研究旨在通過(guò)復(fù)制糖尿病大鼠MIRI模型，觀察不同劑量外源性瘦素預(yù)處理對(duì)大鼠血清瘦素、腫瘤壞死因子α(tumor necrosisfactor-alpha,TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)的影響，探討瘦素預(yù)處理在糖尿病大鼠MIRI中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)SPF雄性SD成年健康大鼠60只，8周齡，體質(zhì)量170～190 g，由桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK 桂 2013-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：室溫18～25 ℃，相對(duì)濕度50%～80%的環(huán)境下，每天日照時(shí)間為8:00-20:00。(2)主要藥品和試劑：鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ，100 mg，美國(guó)sigma公司 S0130)，重組瘦素(200 μg,Leptin，美國(guó)R&D Systems公司)，MDA、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(均為100管/96T，南京建成生物工程研究所)，瘦素放射免疫分析盒(100管/96T，中國(guó)原子能科學(xué)研究所)，125I-胰島素放射免疫分析藥盒(100管/盒，北京科美生物技術(shù)有限公司)。(3)主要儀器：血糖儀(羅氏，卓越型)、小型動(dòng)物呼吸機(jī)、Leica顯微鏡、超聲勻漿機(jī)、高速離心機(jī)、電子秤和BECKMAN全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 飼料 普通飼料由醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。高糖高脂飼料配方為每100.0 g飼料中含標(biāo)準(zhǔn)飼料粉25.5 g、酵母粉0.5 g、大豆粉10.0 g、食鹽0.5 g、豬油15.0 g、蔗糖20.0 g、奶粉10.0 g、麻油5.0 g、蛋黃粉10.0 g、花生10.0 g。將上述配料充分混勻，烤熟壓制成形后喂養(yǎng)，此飼料喂養(yǎng)前臨時(shí)配制。

1.3 分組方法及模型制備 (1)60只健康大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、糖尿病假手術(shù)組、糖尿病假手術(shù)心肌梗死模型組(心肌梗死組)、糖尿病心肌梗死低劑量瘦素預(yù)處理組(低劑量組)、糖尿病心肌梗死中劑量瘦素預(yù)處理組(中劑量組)、糖尿病心肌梗死高劑量瘦素預(yù)處理組(高劑量組)，每組各10只。正常對(duì)照組采用普通飼料喂養(yǎng)4周，而糖尿病5組均采用高糖高脂喂養(yǎng)4周后，禁食12 h腹腔注射STZ(STZ溶于pH值4.2的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)35 mg/kg，注射藥物72 h后大鼠尾靜脈采血測(cè)定血糖，以隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L且持續(xù)1周為造模成功。各組大鼠在術(shù)前均禁食10 h。(2)大鼠心肌梗死模型的制備采用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支。大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉，切開(kāi)頸部正中皮膚，鈍性分離肌肉至氣管。氣管插管接小型動(dòng)物呼吸機(jī)(呼吸頻率為72次/min)。大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支開(kāi)胸結(jié)扎：在胸骨左側(cè)2～3 mm處切開(kāi)皮膚，皮下鈍性分離，暴露心臟，鈍形分離第二肋間隙肋間肌。小心暴露心臟，剪開(kāi)心包膜，用0.9%氯化鈉溶液沾濕的棉簽輕壓心臟。以無(wú)創(chuàng)小圓針進(jìn)針(5-0絲線)在左心耳下緣內(nèi)側(cè)1～2 mm處，深度約為1 mm，經(jīng)由肺動(dòng)脈圓錐右上方出針，留線墊置硅膠管。心肌梗死成功標(biāo)志為：直視下可見(jiàn)被結(jié)扎血管供應(yīng)區(qū)心肌變?yōu)樯n白色或腫脹。缺血30 min后松開(kāi)線結(jié)，開(kāi)放血管再灌注，縫線保留。糖尿病假手術(shù)組不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，僅留線。(3)正常對(duì)照組空腹取血清及心臟標(biāo)本。糖尿病各組均在心肌梗死手術(shù)后3 h取大鼠血清及心臟標(biāo)本，測(cè)定大鼠血清空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、瘦素、HOMA-IR、TNF-α、MDA及血脂水平。

1.4 標(biāo)本制作 術(shù)后3 h大鼠腹腔靜脈取血5 ml，搖勻，抗凝，4 ℃，1 000 r/min低溫離心8 min(離心半徑10 cm)，分離血清置于-70 ℃冰箱保存待測(cè)。大鼠左心室心底部取心肌，50 mg心肌放入0.5 ml 0.9%氯化鈉溶液中，用超聲勻漿機(jī)液氮低溫狀態(tài)下制備心肌勻漿。取大鼠左心室前壁肌組織，石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)。

1.5 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測(cè)定 采用靜脈葡萄糖氧化酶法測(cè)定隨機(jī)血糖、FBG；采用放射免疫法測(cè)定FINS和瘦素；采用ELISA測(cè)定血清TNF-α；采用HPLC法測(cè)定MDA；使用BECKMAN全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)；HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG、FINS、瘦素水平、HOMA-IR比較 與正常對(duì)照組相比，糖尿病假手術(shù)組、心肌梗死組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠FBG、FINS、瘦素水平及HOMA-IR均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與糖尿病假手術(shù)相比，心肌梗死組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠FBG及瘦素水平均升高，心肌梗死組、高劑量組大鼠FINS及HOMA-IR均升高，低劑量組、中劑量組大鼠FINS及HOMA-IR均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與心肌梗死組相比，低劑量組、中劑量組FBG、FINS、瘦素水平及HOMA-IR均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.2 各組大鼠TNF-α、MDA及血脂水平比較 與正常對(duì)照組相比，糖尿病假手術(shù)組、心肌梗死組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠TNF-α、MDA、TG、TC、LDL-C水平均升高，HDL-C水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與糖尿病假手術(shù)組相比，心肌梗死組大鼠TNF-α、MDA水平升高，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠TNF-α、MDA、HDL-C水平升高，而TG、TC、LDL-C水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與心肌梗死組相比，低劑量組、中劑量組大鼠TNF-α、MDA、TG、TC、LDL-C水平均降低，HDL-C水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

2.3 心肌組織病理學(xué)結(jié)果 病理學(xué)顯示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病假手術(shù)組心肌細(xì)胞肥大、變形，部分心肌纖維排列紊亂，局部壞死，有中性粒細(xì)胞聚集現(xiàn)象；心肌梗死組心肌纖維排列紊亂，呈不規(guī)則分布，細(xì)胞結(jié)構(gòu)依稀可見(jiàn)，心肌呈片狀局灶性壞死、出血，并有大量中性粒細(xì)胞聚集；中劑量組心肌細(xì)胞肥大、心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，出血壞死灶與中性粒細(xì)胞聚集明顯減少，病變明顯改善；低劑量組病變有相同改善，但程度遠(yuǎn)不及中劑量組；高劑量組心肌細(xì)胞肥大、心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂、細(xì)胞形態(tài)依稀可見(jiàn)，出血壞死灶及中性粒細(xì)胞聚集情況改變不明顯(見(jiàn)圖1)。

3 討論

糖尿病相關(guān)死亡病因中心血管并發(fā)癥占據(jù)大部分，其中又以缺血性心臟病為主[5-6]。糖尿病患者心力衰竭、再次心肌梗死的發(fā)生率及病死率都是非糖尿病患者的數(shù)倍。MIRI發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，研究表明炎性因子浸潤(rùn)、氧自由基增多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等與其密切相關(guān)，在心肌細(xì)胞缺血糾正后可發(fā)生超微結(jié)構(gòu)不可逆性壞死等[7]。而糖尿病作為心血管疾病獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)與功能的改變，使得心肌對(duì)缺血再灌注的耐受性降低。既往研究表明，2型糖尿病在這一慢性病理狀態(tài)下可發(fā)生IR，通過(guò)抑制胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，降低心肌對(duì)葡萄糖的利用，影響心肌代謝，進(jìn)一步使ATP合成減少，損傷心肌組織[8-9]。

表1 各組大鼠FBG、FINS、瘦素水平及HOMA-IR比較

注：FBG=空腹血糖，F(xiàn)INS=空腹胰島素，HOMA-IR=胰島素抵抗指數(shù)；與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與糖尿病假手術(shù)組比較，△P<0.05；與心肌梗死組比較，▲P<0.05

表2 各組大鼠TNF-α、MDA及血脂水平比較

注：TNF-α=腫瘤壞死因子α，MDA=丙二醛，TG=三酰甘油，TC=總膽固醇，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇；與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與糖尿病假手術(shù)組比較，△P<0.05；與心肌梗死組比較，▲P<0.05

圖1 各組大鼠心臟病理學(xué)改變(HE，×400)

瘦素作為參與調(diào)控機(jī)體攝食、體溫、能量平衡的神經(jīng)肽類(lèi)物質(zhì)，在脂類(lèi)代謝、胰島素分泌等內(nèi)分泌免疫機(jī)制中起重要調(diào)節(jié)作用，且與IR、糖及脂質(zhì)代謝異常等密切相關(guān)[10]。研究證實(shí)，體內(nèi)存在“脂肪-胰島素”內(nèi)分泌軸[11]，通過(guò)這個(gè)內(nèi)分泌軸，瘦素和胰島素對(duì)機(jī)體代謝發(fā)揮著雙向調(diào)節(jié)作用，瘦素的缺乏與過(guò)多均可導(dǎo)致IR。在MIRI過(guò)程中，瘦素水平會(huì)升高，高水平瘦素不僅可通過(guò)增強(qiáng)核因子κB (NF-κB)與活性蛋白的活性，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇，還可促使內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮素1(ET-1)高表達(dá)而使血管痙攣，進(jìn)一步加重心肌損傷[12]。

炎癥作為連接糖尿病和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的紐帶，在相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著媒介與預(yù)測(cè)作用[13-14]。炎性因子可通過(guò)減弱胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的酪氨酸磷酸化參與到IR發(fā)生機(jī)制之中。而TNF-α是體內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要遞質(zhì)，能誘導(dǎo)IR的產(chǎn)生，其可能通過(guò)抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子4(GLUT-4)mRNA的表達(dá)，削弱相關(guān)受體的親和力[11，15]。同時(shí)，TNF-α還可通過(guò)促使中性粒細(xì)胞在缺血心肌組織的聚集、堵塞毛細(xì)血管，并釋放大量氧自由基和蛋白水解酶等物質(zhì)，導(dǎo)致血管通透性的改變引發(fā)水腫進(jìn)而加重心肌損傷[16-17]。

高糖與缺血再灌注時(shí)均可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)大量氧自由基的生成，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，過(guò)多的氧自由基不僅可通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)損傷細(xì)胞膜，而且能誘導(dǎo)凋亡相關(guān)因子的釋放及心肌細(xì)胞線粒體膜通道的開(kāi)放啟動(dòng)瀑布式凋亡反應(yīng)[18-19]，還可影響胰島素傳導(dǎo)系統(tǒng)中蛋白質(zhì)磷酸化的過(guò)程，加重IR狀態(tài)[20]。隨著細(xì)胞內(nèi)氧自由基增多，其代謝產(chǎn)物也增多。MDA作為細(xì)胞內(nèi)最重要的脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物，其水平能反映心肌細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度與氧自由基活性[21]。

本實(shí)驗(yàn)選取糖尿病MIRI大鼠模型，分別給予不同劑量外源性瘦素進(jìn)行干預(yù)。與正常對(duì)照組相比，糖尿病5組大鼠的FINS、瘦素、HOMA-IR、TNF-α與MDA水平均升高；與糖尿病假手術(shù)組相比，心肌梗死組大鼠3 h后，F(xiàn)INS、瘦素、HOMA-IR、TNF-α及MDA水平升高；而與心肌梗死組相比，低劑量組與中劑量組3 h后，F(xiàn)INS、瘦素、HOMA-IR、TNF-α及MDA水平下降；而高劑量組3 h后FINS、瘦素、HOMA-IR、TNF-α及MDA水平不降反而升高。結(jié)果表明：在MIRI時(shí)，低、中劑量瘦素預(yù)處理可通過(guò)減少缺血心肌炎性因子與氧自由基產(chǎn)生，而降低TNF-α、MDA水平；并通過(guò)下調(diào)機(jī)體內(nèi)實(shí)際瘦素水平，發(fā)揮由瘦素與胰島素介導(dǎo)的“脂肪-胰島素”內(nèi)分泌軸激素雙向調(diào)節(jié)反饋?zhàn)饔茫⒖赡芤虼烁纳朴蒚NF-α、氧化應(yīng)激及高瘦素水平所介導(dǎo)的IR狀態(tài)[22]，而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。然而，高劑量瘦素預(yù)處理并未降低機(jī)體內(nèi)實(shí)際瘦素水平，反而進(jìn)一步升高機(jī)體瘦素水平，加劇炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激狀態(tài)及IR，加重糖尿病心肌在缺血再灌注的損傷程度。

2型糖尿病患者普遍存在不同程度的脂質(zhì)代謝紊亂，脂質(zhì)代謝紊亂是2型糖尿病患者并發(fā)急性冠狀動(dòng)脈事件的危險(xiǎn)因素之一[23]。高脂血癥也可影響胰島素受體磷酸激酶的活性和GLUT-4的轉(zhuǎn)位，導(dǎo)致IR，且TG水平與IR密切相關(guān)，其機(jī)制可能為：脂毒性所導(dǎo)致的胰島細(xì)胞功能障礙[24]。本實(shí)驗(yàn)顯示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病5組大鼠血脂TG、TC與LDL-C水平升高，HDL-C水平降低；心肌梗死組與糖尿病假手術(shù)組相比，血脂檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)水平無(wú)差異；與心肌梗死組相比，低劑量組與中劑量組3 h后，TG、TC與LDL-C水平降低，HDL-C水平升高。而高劑量組3 h后，TG、TC、LDL-C、HDL-C水平與心肌梗死組相比無(wú)變化。以上結(jié)果表明：一定濃度的瘦素預(yù)處理能夠改善血脂代謝紊亂，即通過(guò)“脂肪-胰島素”軸——脂肪增加可促使瘦素分泌，一定濃度的瘦素可抑制胰島素分泌，從而減少脂肪的合成與貯存；而高濃度的瘦素預(yù)處理并不會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的調(diào)脂作用。

本研究表明，給予一定濃度外源性瘦素來(lái)干預(yù)糖尿病大鼠MIRI過(guò)程，可對(duì)受損心肌產(chǎn)生相應(yīng)作用，且以低中劑量產(chǎn)生的保護(hù)作用效果最佳。其機(jī)制可能為：(1)低中劑量外源性瘦素預(yù)處理通過(guò)降低內(nèi)源性瘦素實(shí)際水平而改善機(jī)體高瘦素水平狀態(tài)，并通過(guò)瘦素與胰島素之間雙向調(diào)控作用來(lái)改善IR狀態(tài)。(2)低中劑量瘦素預(yù)處理能夠下調(diào)TNF-α、MDA水平減輕心肌局部炎癥和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并因此減少這些因素所介導(dǎo)的IR狀態(tài)而帶來(lái)的損傷。(3)低中劑量瘦素預(yù)處理能夠通過(guò)“脂肪-胰島素”軸改善糖尿病大鼠血脂代謝紊亂狀況。

綜上所述，在2型糖尿病大鼠MIRI發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程中，機(jī)體存在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、高瘦素水平、IR及血脂紊亂等狀態(tài)，而低中劑量瘦素預(yù)處理可通過(guò)改善這些狀態(tài)而降低心肌損害作用，這為糖尿病患者M(jìn)IRI的防治提供了新的方向。

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