張磊昌，何純鋼，曹云飛，鐘 武，鐘世彪，龍軍先，黃永紅，陳利生

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤的第三位[1]，且其發(fā)病率從1992年以來每年以1.2%的速度升高[2]。原衛(wèi)生部統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國結(jié)直腸癌病死率位居惡性腫瘤第五位，發(fā)病率亦呈逐年上升趨勢[3]。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟的、涉及遺傳和表觀遺傳變化積累的復(fù)雜過程[4]。甲基化是表觀遺傳學(xué)多種作用機(jī)制中研究得最為廣泛和深入的一種，其與基因的表達(dá)抑制和功能喪失有關(guān)[5]，在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[6]。既往研究表明，散發(fā)性結(jié)直腸癌組織p33ING1b啟動子存在高甲基化現(xiàn)象[7]。p33ING1b是抑癌基因ING1編碼的4種蛋白之一，近年來已成為研究熱點(diǎn)[8]。本研究通過檢測散發(fā)性結(jié)直腸癌組織p33ING1b啟動子甲基化情況，分析其與患者臨床病理特征及p33ING1b mRNA表達(dá)水平的關(guān)系，并進(jìn)行5-氮-2-脫氧胞苷(5-aza-dC)干預(yù)實驗，旨在探討p33ING1b在散發(fā)性結(jié)直腸癌中轉(zhuǎn)錄抑制的可能機(jī)制，為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標(biāo)本來源 選擇2008年10月—2012年3月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科住院的散發(fā)性結(jié)直腸癌患者63例，均行結(jié)直腸癌根治術(shù)并經(jīng)病理檢查證實，取其癌組織及相應(yīng)癌旁組織切除標(biāo)本。63例患者中男36例，女27例；年齡24～81歲，中位年齡58歲；結(jié)腸癌28例，直腸癌35例；Dukes分期：A/B期24例，C/D期39例；分化程度：高、中分化腺癌37例，低分化腺癌26例；26例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，7例有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。同時選擇在我院行吻合器痔上黏膜環(huán)切術(shù)(PPH)患者13例，收集其術(shù)后痔上黏膜組織，均經(jīng)結(jié)腸鏡檢查證實結(jié)直腸黏膜無異常。所有樣本獲取過程獲得患者本人同意及本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞株 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD-1、Caco-2均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.3 主要儀器和試劑 5-aza-dC購自Sigma公司，亞硫酸氫鈉(NaHSO3)購自S9000 Sigma公司，細(xì)胞培養(yǎng)基(高糖DMEM，1640)購自Hyclone公司，TRIzol購自Invitrogen公司，Long Taq DNA聚合酶購自北京天根生物公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI Fermentas公司；多通道PCR儀(PTC-220)購自MJ Research公司，凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)(Gel Doc 2000型)購自Bio-Rad公司，紫外分光光度計購自Pharmacia公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 p33ING1b啟動子甲基化檢測 采用巢式-甲基化特異性PCR(nMSP法)：(1)蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，提取癌組織、癌旁組織、痔上黏膜組織DNA，計算DNA濃度及OD260/OD280比值，檢測DNA純度；(2)嚴(yán)格按照Methyl Detector Bisulfite Modification Kit說明書步驟對DNA進(jìn)行NaHSO3修飾及純化；(3)參照文獻(xiàn)[9]并采用Primer軟件設(shè)計引物，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成引物序列(見表1)；(4)PCR反應(yīng)：第一輪采用修飾的瓊脂糖珠DNA作為模板，使用巢式引物進(jìn)行PCR，循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性94 ℃ 4 min，94 ℃變性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，第二輪模板為第一輪PCR產(chǎn)物，選用甲基化/非甲基化引物進(jìn)行PCR，循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性94 ℃ 4 min，94 ℃變性30 s、62.5 ℃退火30 s、72 ℃延伸25 s共35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min；(5)PCR產(chǎn)物分析：將第二輪PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，采用凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察并照相。

表1 p33ING1b啟動子巢式-甲基化特異性PCR和RT-PCR引物序列

Table1 Primer sequence of p33ING1b for nested methylation PCR and RT-PCR

引物名稱引物序列引物長度(bp)巢式-甲基化特異性PCR引物(上游)5′-AGATAAGGTTTAGGGAAGGYGTT-3′441巢式-甲基化特異性PCR引物(下游)5′-AACAACCRCAATAACCAATCTACT-3′甲基化引物(上游)5′-CGGATGGCGTAGGCGCGGGAGTC-3′151甲基化引物(下游)5′-CCGAACACGAACGAAAATAACGACGC-3′非甲基化引物(上游)5′-TGGATGGTGTAGGTGTGGGAGTT-3′151非甲基化引物(下游)5′-CCAAACACAAACAAAAATAACAACACA-3′RT-PCR引物(上游)5′-CTCGTAGCACTCGTCTAGCTCCTT-3′103RT-PCR引物(下游)5′-GAGTCCCTGCCTTTCGACTTG-3′β-actinRT-PCR引物(上游)5′-CACAGAGCCTCGCCTTTGCC-3′106β-actinRT-PCR引物(下游)5′-CACATGCCGGAGCCGTTGTC-3′

1.2.2 癌組織p33ING1b mRNA表達(dá)水平 以TRIzol一步法抽提癌組織細(xì)胞總RNA，取總RNA 3 μg，采用RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒，再以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2 μl作為模板，對p33ING1b mRNA表達(dá)水平進(jìn)行半定量PCR檢測，以β-actin為內(nèi)參基因(引物序列見表1)，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4 μl在2.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

1.2.3 5-aza-dC干預(yù)實驗 取對數(shù)生長期人結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD-1、Caco-2，采用0.02% EDTA+0.25%胰酶消化，反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，以每孔2×105個接種于6孔板中，次日更換為含10 μM 5-aza-dC的DMEM培養(yǎng)基，每24 h更換含10 μM 5-aza-dC培養(yǎng)液，以未用10 μM 5-aza-dC處理的細(xì)胞作為對照組，96 h后提取細(xì)胞總RNA。人結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD-1、Caco-2的p33ING1b啟動子甲基化檢測和mRNA表達(dá)水平檢測方法同上。

2 結(jié)果

2.1 p33ING1b啟動子甲基化情況 采用nMSP法成功擴(kuò)增出癌組織、癌旁組織、痔上黏膜組織甲基化及非甲基化條帶，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序證實所擴(kuò)增片段為目的片段(見圖1)。癌組織p33ING1b啟動子甲基化陽性率為82.5%(52/63)，癌旁組織為34.2%(27/63)，均為不完全甲基化；痔上黏膜組織未檢測出p33ING1b啟動子甲基化(見圖2)。癌組織、癌旁組織、痔上黏膜組織p33ING1b啟動子甲基化陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=39.1，P<0.001)；且癌組織p33ING1b啟動子甲基化陽性率高于癌旁組織和痔上黏膜組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=21.21，P<0.001；χ2=33.98，P<0.001)。

2.2 p33ING1b啟動子甲基化與患者臨床病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡、腫瘤位置、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者癌組織p33ING1b啟動子甲基化陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；不同Dukes分期患者癌組織p33ING1b啟動子甲基化陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.3 p33ING1b啟動子甲基化與癌組織p33ING1b mRNA表達(dá)水平的關(guān)系 p33ING1b啟動子甲基化癌組織p33ING1b mRNA相對表達(dá)量為(0.62±0.15)，低于p33ING1b啟動子非甲基化癌組織的(0.75±0.17)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.553，P<0.05)。

2.4 5-aza-dC干預(yù)結(jié)果 5-aza-dC干預(yù)后，人結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD-1、Caco-2的p33ING1b啟動子甲基化均被逆轉(zhuǎn)(見圖3)，兩者p33ING1b mRNA相對表達(dá)量較干預(yù)前升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

表2 p33ING1b啟動子甲基化與患者臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

Table2 Correlation between promoter methylation of p33ING1b and clinical pathology characteristics

例數(shù)p33ING1b啟動子甲基化 非甲基化χ2值P值性別00370840 男3630(833)6(167) 女2722(815)5(185)年齡(歲)06770411 ≤583326(788)7(212) >583026(867)4(133)腫瘤位置15920207 結(jié)腸2825(893)3(107) 直腸3527(771)8(229)分化程度00010979 高、中分化3730(8008)7(1892) 低分化2622(8462)4(1538)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10780299 有2623(885)3(115) 無3729(784)8(216)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移00550814 有 7 6(857) 1(143) 無5646(821)10(179)Ducks分期42420047 A/B期2414(5833)10(4167) C/D期3932(8205) 7(1795)

圖1 巢式-甲基化特異性PCR產(chǎn)物直接測序結(jié)果

Table3 Comparison of relative expression of p33ING1b in DLD-1 and Caco-2 cells before and after interference of 5-aza-dC

DLD-1Caco-2干預(yù)前 210±029 118±014干預(yù)后 400±055 184±034差值-190±062-066±037t值-5258-3061P值 0006 0038

3 討論

Campus等[10]研究表明，p33ING1b與細(xì)胞生長增殖抑制、凋亡，腫瘤非依賴性生長、衰老，基因組穩(wěn)定性維持等存在一定的關(guān)聯(lián)。既往研究顯示，p33ING1b在人類結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下降，但突變、雜合性缺失非常少見，其表達(dá)下降并不是p33ING1b轉(zhuǎn)錄抑制的主要原因[11-12]。結(jié)直腸癌[7]、卵巢癌[9]中p33ING1b存在高甲基化現(xiàn)象，但目前尚無有力證據(jù)支持p33ING1b啟動子甲基化為結(jié)直腸癌中p33ING1b轉(zhuǎn)錄抑制的原因。

注：A為甲基化，B為非甲基化；1、2、3、4、5為癌組織，6、7、8、9、10為癌旁組織，11、12、13為痔上黏膜組織，14、15、16分別為陽性對照、陰性對照、空白對照

圖2 癌組織、癌旁組織、痔上黏膜組織p33ING1b啟動子甲基化PCR產(chǎn)物電泳圖

Figure2 Electrophoretogram of p33ING1b PCR products in tumor，adjacent tissue and normal mucosa tissue

注：A為干預(yù)前，B為干預(yù)后；1、2為人結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD-1，3、4、5為人結(jié)直腸癌細(xì)胞株Caco-2，6、7、8分別為陽性對照、陰性對照、空白對照

圖3 5-aza-dC干預(yù)前后人結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD-1、Caco-2的p33ING1b啟動子甲基化情況

Figure3 Condition of promoter methylation of p33ING1b in DLD-1 and Caco-2 cells before or after interference of 5-aza-dC

本研究結(jié)果顯示癌組織p33ING1b啟動子甲基化陽性率高于癌旁組織和痔上黏膜組織，提示p33ING1b啟動子甲基化與散發(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。曹云飛等[7]研究顯示，結(jié)直腸癌組織p33ING1b啟動子甲基化陽性率為48.33%，本研究為82.5%，存在較大差異，分析其原因可能在于采用的檢測方法不同，曹云飛等[7]采用的是甲基化特異性PCR(MSP)，本研究采用的是nMSP法，而前者的檢測敏感度遠(yuǎn)不如nMSP法[13]。本研究對p33ING1b啟動子甲基化與患者臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其與患者性別、年齡、腫瘤位置、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)，僅與Dukes分期有關(guān)；對p33ING1b啟動子甲基化與癌組織p33ING1b mRNA表達(dá)水平的關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，p33ING1b啟動子甲基化癌組織p33ING1b mRNA相對表達(dá)量低于p33ING1b啟動子非甲基化癌組織。進(jìn)一步行5-aza-dC干預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，5-aza-dC可有效逆轉(zhuǎn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD-1、Caco-2的甲基化，并顯著上調(diào)p33ING1b mRNA表達(dá)水平，提示p33ING1b啟動子甲基化可能是導(dǎo)致p33ING1b基因轉(zhuǎn)錄抑制的原因。劉麗喬等[14]的研究也表明5-aza-dC對人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2中P16基因啟動子具有去甲基化作用，并可使其mRNA重新表達(dá)。

綜上所述，p33ING1b啟動子甲基化與散發(fā)性結(jié)直腸癌存在關(guān)聯(lián)，并可能通過抑制p33ING1b mRNA的表達(dá)參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展；5-aza-dC能有效逆轉(zhuǎn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD-1、Caco-2的甲基化，并上調(diào)p33ING1b mRNA表達(dá)水平，這為結(jié)直腸癌的診斷和去甲基化治療提供了一定的實驗依據(jù)。

1 Jemal A，Brav F，Center MM，et al.Global cancer statistics[J].Ca Cancer J Clin，2011，61(2)：69-90.

2 Migliore L，Migheli F，Spisni R，et al.Genetics，cytogenetics，and epigenetics of colorectal cancer[J].J Biomed Biotechnol，2011，2011：792362.

3 衛(wèi)生部.2011年中國衛(wèi)生統(tǒng)計提要[R].2011.

4 Lao VV，Grady WM.Epigenetics and colorectal cancer[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2011，8(12)：686-700.

5 Laird PW.Principles and challenges methylation analysis of genome-wide DNA[J].Nat Rev Genet，2010，11(3)：191-203.

6 Jensen LH，Lindebjerg J，Byriel L，et al.Strategy in clinical practice for classification of unselected colorectal tumours based on mismatch repair deficiency[J].Colorectal Disease，2008，10(5)：490-497.

7 曹云飛，陳利生，高楓.ING1啟動子甲基化在散發(fā)性結(jié)直腸癌中的研究[J].中華實驗外科，2005，22(12)：1554.

8 Saito A，F(xiàn)urukawa T，F(xiàn)ukushige S，et al.p24/ING1-ALT1 and p47/ING1-ALT2，distinct alternative transcripts of p33/ING1[J].J Hum Genet，2000，45(3)：177-181.

9 Shen DH，Chan KY，Khoo US，et al.Epigenetic and genetic alterations of p33ING1b in ovarian cancer[J].Carcinogenesis，2005，26(4)：855-863.

10 Campus EI，Chin MY，Kuo WH，et al.Biological functions of the ING family tumor suppressors[J].Cell Mol Life Sci，2004，61(19)：2597-2613.

11 Chen LS，Wei JB，Zhou YC，et al.Genetic alterations and expression of inhibitor of growth 1 in human sporadic colorectal cancer[J].World J Gastroenterol，2005，11(39)：6120-6124.

12 Wei JB，Chen LS，Gao F.Mutation，loss of heterozygosity，and expression of tumor suppressor gene ING1 in sporadic colorectal carcinoma[J].Ai Zheng，2005，24(2)：141-144.

13 何純剛，陳利生，曹云飛，等.p33生長抑制基因1b啟動子甲基化檢測方法的建立與評價[J].中華實驗外科，2009，26(7)：945.

14 劉麗喬，羅達(dá)雅，付晶晶，等.5-Aza-CdR對人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株P(guān)16基因甲基化狀態(tài)及其生物學(xué)表型的影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31(2)：161-165.