李 娜，周明錦，陳 楠

兒童非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)包括以三酰甘油(TG)在肝臟中堆積為特征的獨(dú)立肝細(xì)胞脂肪變性、由相連的脂質(zhì)積累引起肝細(xì)胞損傷和炎癥及各種程度的纖維化為特征的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)[1]。即使是兒童NASH，也可以進(jìn)展為肝硬化，并引起一系列并發(fā)癥。目前，NASH診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是肝組織活檢。然而肝組織活檢是侵入性的，價(jià)格昂貴且可能導(dǎo)致并發(fā)癥。因此，不能很好地適用于篩查和監(jiān)測兒童大多無癥狀的非酒精性脂肪肝[2]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)主要在肝臟內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生，在炎癥反應(yīng)中起到關(guān)鍵性作用。最近發(fā)展出一項(xiàng)替代篩選試驗(yàn)：測量血漿中細(xì)胞角蛋白18(CK-18)的水平[3]。CK-18是肝臟中的主要中間絲蛋白。與脂肪有關(guān)的損害導(dǎo)致細(xì)胞受傷，進(jìn)而凋亡，半胱天冬酶裂解CK-18進(jìn)入血液。這種凋亡與NASH相關(guān)，但與肝脂肪變性無關(guān)，因此血液中CK-18能區(qū)分兩種不同NAFLD病變[4]。CK-18一直作為成人NASH生物標(biāo)志物被廣泛地研究，并證明能夠區(qū)別脂肪性肝炎。研究表明細(xì)胞損傷后TNF-α的增加常會伴有CK-18水平的升高，兩者可能存在協(xié)同作用，參與并促進(jìn)NASH的發(fā)生與發(fā)展[5]。因此，本研究通過檢測血清TNF-α和CK-18水平，評估其作為兒童NASH非侵入性生物標(biāo)志物的效果，并評估其與組織學(xué)檢查結(jié)果的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年2月—2013年3月在鄭州市兒童醫(yī)院內(nèi)科住院、肝組織活檢證實(shí)為NAFLD的患兒88例為研究對象，其中男57例，女31例；年齡9～13歲，平均(10.6±2.4)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝組織活檢證實(shí)為NAFLD；(2)肝臟超聲為彌漫性高回聲并提示脂肪肝；(3)血清轉(zhuǎn)氨酶水平持續(xù)升高。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)實(shí)驗(yàn)室檢查證實(shí)為病毒性肝炎患兒；(2)飲酒、腸外營養(yǎng)史及使用已知藥物誘發(fā)脂肪肝者；(3)自身免疫性肝病及代謝性肝?。?4)α-1-抗胰蛋白酶相關(guān)肝病?；純杭凹覍倬炇鹬橥鈺?。

1.2 一般指標(biāo)檢測 測量患兒身高、體質(zhì)量并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(BMI)，根據(jù)美國兒童肥胖專家委員會推薦的兒童肥胖診斷標(biāo)準(zhǔn)，BMI大于或等于同年齡同性別人群第95百分位數(shù)值為肥胖。代謝綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合以下5條中3條即可定義：(1)肥胖(腰圍≥同年齡、同性別第90百分位)。(2)TG≥同年齡、同性別第90百分位。(3)高密度脂蛋白(HDL)≤同年齡、同性別第10百分位。(4)血壓≥同年齡、同性別第90百分位。(5)餐前血糖升高。測量非同日3次患兒清晨靜息血壓，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的關(guān)于兒童高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)患有高血壓的人數(shù)。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR) =(空腹外周血糖×胰島素)/22.5。

1.3 血清學(xué)指標(biāo)測量 取患兒清晨空腹靜脈血10 ml置于抗凝管中，于離心機(jī)3 000 r/m離心15 min(離心半徑7.5 cm)后取上層血清液置于-20 ℃凍存?zhèn)錂z。采用全自動生化分析儀檢測總膽固醇(TC)、TG、清蛋白、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒說明書檢測血清TNF-α和CK-18水平，檢測試劑緩沖液配方為0.132 mol/L Tris-HCl(pH 8.5)、2.63 mol/L氯化鈉(NaCl)、1.32 mmol/L氯化鈣(CaCl2)。當(dāng)患兒TC、TG水平高于同齡兒童第75百分位數(shù)值時(shí)則認(rèn)為患兒有高膽固醇血癥及高三酰甘油血癥。

1.4 肝組織活檢 對符合臨床適應(yīng)證的患兒進(jìn)行肝組織活檢，以評估NASH和纖維化程度，或其他可能獨(dú)立或合并的肝病。肝組織活檢：禁食一夜后，使用自動芯活檢18號針在全身麻醉及超聲指導(dǎo)下進(jìn)行。記錄肝標(biāo)本的長度。選取連續(xù)的長度15 cm以上，并包括至少6個(gè)完整的肝小葉樣品。樣品采用甲醛溶液固定后進(jìn)行石蠟包埋，切片5 μm厚，用蘇木素-伊紅染色。根據(jù)Brunt等[6]提出的NAFLD活動性評分系統(tǒng)(NAS)進(jìn)行分級：(1)脂肪變(0～2分)：5%～33%、34%～65%、≥66%，(2)小葉炎癥(0～3分)：無病灶、<2個(gè)病灶、2～4個(gè)病灶、>4個(gè)病灶，(3)匯管區(qū)炎癥(0～2分)：無、輕、中/重，(4)氣球樣變(0～2分)：無、少許、較多。4項(xiàng)評分之和(NASH炎癥評分)≥6分診斷為NASH，否則為非NASH。

2 結(jié)果

2.1 NASH組及非NASH組患兒一般資料比較 NASH組64例，非NASH組24例。兩組患兒性別、年齡、BMI、高血壓發(fā)生率、HOMA-IR、清蛋白水平、高三酰甘油血癥發(fā)生率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而NASH組肥胖、代謝綜合征、高膽固醇血癥發(fā)生率，TC、TG、AST、ALT、TNF-α、CK-18水平高于非NASH組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2 兩組患兒病理資料比較 NASH組與非NASH組患兒不同程度脂肪變、小葉炎癥、匯管區(qū)炎癥、氣球樣變發(fā)生率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NASH組患兒NASH炎癥評分高于非NASH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.3 血清TNF-α、CK-18水平與NASH炎癥評分的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示，血清TNF-α、CK-18水平與NASH炎癥評分均呈正相關(guān)(rs=0.69，P<0.05；rs=0.73，P<0.05)。

以NASH炎癥評分為因變量，TNF-α為自變量，行直線回歸分析，兩者的直線回歸方程為：NASH炎癥評分=0.05×TNF-α-2.08，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=114.24，P=0.000)。以NASH炎癥評分為因變量，CK-18為自變量，行直線回歸分析，兩者的直線回歸方程為：NASH炎癥評分=0.1×CK-18+0.58，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=125.15，P=0.000)。

2.4 NASH組不同病理特征患兒TNF-α、CK-18水平比較 不同程度脂肪變、小葉炎癥、匯管區(qū)炎癥、氣球樣變NASH組患兒TNF-α水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為4.15、6.93、5.80和7.18，P值分別為0.04、0.01、0.02和0.00)；NASH組患兒隨著脂肪變、小葉炎癥、匯管區(qū)炎癥、氣球樣變程度的加重TNF-α水平逐漸升高，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。不同程度脂肪變、小葉炎癥、匯管區(qū)炎癥、氣球樣變NASH組患兒CK-18水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為6.72、5.93、6.13和5.58，P值分別為0.01、0.02、0.02和0.03)；NASH組患兒隨著脂肪變、小葉炎癥、匯管區(qū)炎癥、氣球樣變程度的加重CK-18水平逐漸升高，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

2.5 NASH組患兒脂肪變、小葉炎癥、匯管區(qū)炎癥、氣球樣變程度與TNF-α、CK-18水平相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，NASH組患兒脂肪變、小葉炎癥、匯管區(qū)炎癥、氣球樣變程度與TNF-α、CK-18水平均呈正相關(guān)(P<0.05，見表3)。

2.6 ROC曲線下面積分析 以TNF-α、CK-18水平為檢驗(yàn)變量，以病理診斷結(jié)果為狀態(tài)變量做ROC曲線，TNF-α ROC曲線下面積為0.83，CK-18 ROC曲線下面積為0.92。取TNF-α截點(diǎn)值為136 μg/L時(shí)，可獲得最佳靈敏度0.79和特異度0.75。取CK-18截點(diǎn)值為42 μg/L，可獲得最佳靈敏度0.82和特異度0.85(見圖3)。

表1 NASH組及非NASH組患兒一般資料比較Table 1 Comparison of basic data between NASH group and non-NASH group

注：BMI=體質(zhì)指數(shù)，HOMA-IR=胰島素抵抗指數(shù)，TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，AST=天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，ALT=丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，TNF-α=腫瘤壞死因子α，CK-18=細(xì)胞角質(zhì)蛋白18；*為χ2值，△為U值，余檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值為t值

表2 NASH組與非NASH組患兒病理資料比較Table 2 Comparison of pathological data between NASH group and non-NASH group

注：*為t值

圖1 NASH組不同病理特征患兒TNF-α水平比較Figure 1 Comparison of TNF-α levels in children with different pathological features in NASH group

圖2 NASH組不同病理特征患兒CK-18水平比較Figure 2 Comparison of CK-18 levels in children with different pathological features in NASH group

表3 NASH組患兒脂肪變、小葉炎癥、匯管區(qū)炎癥、氣球樣變程度與TNF-α、CK-18水平相關(guān)性分析

Table3 Correlation analysis on TNF-α and CK-18 levels with different degrees of pathological features in children in NASH group

病理類型TNF-αrs值(95%CI) P值CK-18rs值(95%CI) P值脂肪變0 72(0 61，0 81)<0 050 78(0 67，0 86)<0 05小葉炎癥0 46(0 33，0 56)<0 050 55(0 41，0 63)<0 05匯管區(qū)炎癥0 58(0 44，0 68)<0 050 49(0 36，0 62)<0 05氣球樣變0 74(0 61，0 85)<0 050 79(0 61，0 85)<0 05

3 討論

NAFLD被越來越多的學(xué)者認(rèn)為是胰島素抵抗和代謝綜合征在肝臟的體現(xiàn)。NASH可能是成人慢性肝臟疾病最常見的形式。NASH是NAFLD的一種類型，已被證實(shí)有可能進(jìn)展為肝硬化和肝癌。現(xiàn)在NASH還被認(rèn)為是進(jìn)展型的脂肪肝疾病。組織學(xué)診斷仍然是評估NASH炎癥及纖維化程度的準(zhǔn)確手段。Matteoni等[7]研究表明21%～28%的肝硬化患者肝組織活檢可以表現(xiàn)為肝脂肪變、炎癥、氣球樣變及纖維化的綜合狀態(tài)。研究表明，血清TNF-α和CK-18水平常與肝細(xì)胞損傷相關(guān)[8]。為了找到一種非侵入性的評估及診斷NASH的方法，本研究通過檢測血清TNF-α和CK-18水平，評估其作為兒童NASH非侵入性生物標(biāo)志物的效果，并評估其與組織學(xué)檢查結(jié)果的相關(guān)性。

注：A為TNF-α；B為CK-18

圖3 TNF-α、CK-18診斷NASH的ROC曲線

Figure3 ROC curve of TNF-α and CK-18 in diagnosing NASH

TNF-α可以通過激活神經(jīng)鞘磷脂酸來抑制細(xì)胞線粒體呼吸鏈的電子傳遞過程，使得線粒體內(nèi)的活性氧生成增多，促使肝細(xì)胞的炎癥發(fā)生及壞死[9]。肝細(xì)胞的炎癥和壞死同時(shí)能促進(jìn)TNF-α的表達(dá)，使其產(chǎn)生“二次打擊”[10]。TNF-α同時(shí)也被證實(shí)在胰島素抵抗機(jī)制中起關(guān)鍵作用，不僅與葡萄糖和脂類代謝紊亂有關(guān)，還參與到從脂肪肝發(fā)展為NASH再到肝纖維化的整個(gè)病理過程。CK-18在皮脂腺、消化道腫瘤、前列腺癌組織中表達(dá)[11]。CK-18同時(shí)在細(xì)胞凋亡后被釋放入血液中。在肝細(xì)胞受到損害后，細(xì)胞凋亡激活細(xì)胞內(nèi)溶解酶系統(tǒng)，使得微絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)水解斷裂并將CK-18釋放入血液中，CK-18可以反映細(xì)胞凋亡的水平[12]。

TNF-α作為一種細(xì)胞炎性遞質(zhì)、CK-18作為肝細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物均在診斷兒童NASH中具有較高的準(zhǔn)確度，本研究結(jié)果表明，NASH組患兒TNF-α、CK-18水平高于非NASH組。TNF-α、CK-18診斷NASH的ROC曲線下面積分別為0.83、0.92。TNF-α、CK-18水平與肝組織活檢的NASH患兒病理特征程度、NASH炎癥評分均呈正相關(guān)。許多研究表明，CK-18在成人NASH的診斷中具有較好的準(zhǔn)確度[13]。有研究表明CK-18水平每升高50 μg/L，其發(fā)生NASH的危險(xiǎn)度增加1.7倍[14]。近期也有Meta分析指出CK-18預(yù)測成人NASH的平均ROC曲線下面積為0.82，TNF-α預(yù)測成人NASH的平均ROC曲線下面積為0.78[15]。最近有兩項(xiàng)關(guān)于評估血漿CK-18對兒童NAFLD疾病嚴(yán)重程度預(yù)測價(jià)值的研究。Fitzpatrick 等[16]指出NASH患兒CK-18水平中位數(shù)顯著高于有脂肪肝的NAFLD患兒。Lebensztejn等[17]指出CK-18可以作為肝纖維化的標(biāo)志蛋白之一，其發(fā)現(xiàn)肝纖維化評分越高的患者CK-18水平越高。上述的研究樣本量均較小，且血漿獲取時(shí)間和活檢時(shí)間存在差異，這使得其結(jié)果可信度有所下降。本試驗(yàn)選取相對多的樣本量，在肝組織活檢的當(dāng)天取患兒靜脈血檢測，并根據(jù)代謝綜合征的危險(xiǎn)因素進(jìn)行匹配。

綜上所述，血清TNF-α和CK-18水平能夠較好地在NAFLD疾病譜中預(yù)測存在NASH。其可以作為一種非侵入式的評估方法來診斷NASH，為早期的臨床干預(yù)提供指導(dǎo)。在未來的研究中，我們將評估TNF-α和CK-18的縱向變化與疾病發(fā)展和治療干預(yù)的反應(yīng)性變化，以便為臨床的治療提供更全面有力的證據(jù)。

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