艾 婷，周 軍，陳 濤，胡 衛(wèi)，萬信念，?？〗?/p>

乳腺癌是最常見的導致婦女死亡的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計在西方國家，乳腺癌每年的發(fā)病率和死亡率在所有婦女癌癥中是最高的，且呈逐年增加的趨勢，嚴重威脅女性的健康。預計到2030年，乳腺癌的死亡率將是現(xiàn)在的兩倍［1］。中藥復方目前仍是中醫(yī)藥防治腫瘤的主流，QHF復方是從具有清熱解毒(Q)、活血化瘀 (H)、扶正固本 (F)作用的中藥中提取的多個抗腫瘤有效組分，通過文獻研究及動物實驗，并采用均勻設計法篩選得到的成分組方［2］。前期實驗已經(jīng)表明QHF復方在體內(nèi)具有良好的抗腫瘤作用，本實驗擬進一步研究其體外抗癌作用的效果及可能的機制。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 人乳腺癌MCF-7細胞系華中科技大學同濟醫(yī)學院惠贈。華蟾素注射液購自安徽金蟾生化股份有限公司，國藥準字:Z34020273，批號:120811-3，規(guī)格:5 ml/支;20(R)人參皂苷Rg3標準品購自上海源葉生物科技有限公司，批號:20120506，規(guī)格:20 mg/瓶;香菇多糖購自南京澤朗植提技術有限公司，規(guī)格:1 g/包;注射用血塞通 (凍干)購自昆明制藥集團股份有限公司，國藥準字:Z20026438，批號:12GA12，規(guī)格:400 mg/支;注射用鹽酸多柔比星購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司，國藥準字:H33021980，批號:012027CF，規(guī)格:10 mg/支;DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;胎牛血清購自美國Sigma公司;胰蛋白酶購自上海源葉生物科技有限公司;人血管內(nèi)皮生長因子酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海勁馬有限公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 藥物的配制 (1)20(R)人參皂苷Rg3原液的配制:用分析天平準確稱取10 mg 20(R)人參皂苷Rg3，在超凈工作臺上加入400μl二甲基亞砜 (DMSO)溶解，加DMEM培養(yǎng)基至10ml，使其濃度為1mg/ml，4℃冰箱保存。(2)三七總皂苷原液的配制:用分析天平準確稱取血塞通凍干粉末10 mg，在超凈工作臺上加DMEM培養(yǎng)基至10 ml，使其濃度為1 mg/Ml，4℃冰箱保存。(3)香菇多糖原液的配制:用分析天平準確稱取60 mg香菇多糖，在超凈工作臺上加DMEM培養(yǎng)基至10 ml，使其濃度為10 mg/ml，4℃冰箱保存。(4)中藥QHF復方的配制:按照華蟾素∶人參皂苷Rg3∶三七總皂苷∶香菇多糖=57∶1∶0．4∶7的比例進行配制。QHF濃度從高到低依次命名為:QHF1、QHF2、QHF3、QHF4和QHF5，每次配制3 ml。配方見表1，4℃冰箱保存。(5)鹽酸多柔比星原液的配制:在超凈工作臺上，加DMEM培養(yǎng)基將鹽酸多柔比星稀釋至1 mg/ml，4℃冰箱避光保存。

1．2．2 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7細胞用含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃，含5%二氧化碳 (CO2)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液一次，當細胞穩(wěn)定生長并處于對數(shù)生長期時用于實驗。

表1 QHF復方的配制 (3 ml)Table 1 Preparation of QHF

1．2．3 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法 (MTT法)測定中藥QHF復方對細胞生長的影響 取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，用0．25%胰蛋白酶消化后收集細胞計數(shù)，以2×104個細胞/孔的濃度接種于96孔板，37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后給藥。設空白組 (不加細胞)、正常對照組、陽性對照組 (加入鹽酸多柔比星使其終濃度為2．5μg/ml)、QHF藥物組 (分為5個濃度)分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，每個濃度和時間點設5個復孔。藥物作用時間終止前4 h，于每孔中各加入5 mg/ml MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)細胞4 h。吸棄96孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入150μl DMSO，搖床上振蕩5 min，使紫色結(jié)晶充分溶解。于酶標儀上在波長570 nm處檢測各孔光密度值。按下列公式計算藥物對腫瘤細胞的生長抑制率=〔(正常對照組OD值-實驗組OD值)/(正常對照組OD值-空白組OD值)〕 ×100%。

1．2．4 流式細胞儀檢測細胞周期 根據(jù)MTT法計算出中藥QHF復方半數(shù)抑制濃度 (IC50)，將實驗分為正常對照組、QHF復方組 (濃度為IC50)、鹽酸多柔比星組、聯(lián)合用藥組(中藥QHF復方+鹽酸多柔比星)。取對數(shù)生長期細胞用胰酶消化后臺盼藍染色，細胞計數(shù)，細胞活力大于95%，調(diào)整細胞濃度為2×104/ml。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。消化收集細胞制備單細胞懸液，將細胞重懸于1 ml75%的冰乙醇中，4℃固定過夜。過夜后，800 r/min離心5 min(離心半徑135 mm)，棄去固定液，磷酸鹽緩沖液 (PBS)3 ml沖洗2次，800 r/min離心5 min(離心半徑135 mm)，每個標本加入40μg/Ml RNA酶400μl，37℃水浴30 min，然后每個標本加入碘化并啶(PI)染液100μl混勻，4℃避光染色30 min，用300目尼龍膜過濾后上流式細胞儀檢測細胞周期。

1．2．5 酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)法檢測細胞上清液中血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)的含量 收集不同濃度中藥QHF復方處理后的MCF-7細胞上清液，檢測各組上清液中VEGF含量，具體的實驗步驟按試劑盒操作說明進行。

1．2．6 細胞遷移實驗 取對數(shù)生長期細胞用胰酶消化后，用含0．2%胎牛血清清蛋白 (BSA)的無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，臺盼藍染色，細胞計數(shù)，細胞活力大于95%，調(diào)整細胞濃度為7×104/ml。取100μl細胞懸液加入Transwell小室的上室中，分別加入不同濃度的中藥QHF復方，使上室中的液體總濃度為200μl。下室中加入600μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將小室放入，于37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄小室內(nèi)的培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦去膜內(nèi)表面的細胞，用4%多聚甲醛固定1 h，結(jié)晶紫染色30 min后，清水沖洗3次，用鑷子輕輕揭下濾膜，放在載玻片上。200倍光鏡下觀察濾膜外的細胞，隨機選擇5個視野進行細胞計數(shù)，計算出平均值。

1．2．7 細胞侵襲實驗 將盛有Matrigel膠的EP管從-20℃冰箱中取出，4℃過夜融化。用預冷的槍頭將Matrigel膠與無血清的DMEM培養(yǎng)基按1∶3稀釋。在小室濾膜的上表面涂一層50μl稀釋過的Matrigel膠，放入37℃，CO2的培養(yǎng)箱中30 min，使其聚合成凝膠，用之前在紫外燈下殺菌2 h。其余步驟同遷移性實驗。

1．3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以 (±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 中藥QHF復方對MCF-7細胞的體外增殖抑制效果MTT實驗結(jié)果顯示:不同濃度的QHF作用于MCF-7細胞24、48、72 h后，隨著中藥QHF復方濃度的增加，生長抑制率不斷增加;且隨著時間延長，生長抑制率逐漸增加 (=18．383，P ＜0．01，見圖 1)。24、48、72 h的中藥 QHF 復方IC50值對應華蟾素濃度分別為 214．3、44．8、2．8 μl。

2．2 流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果 作用48 h后，與正常對照組比較，QHF復方組、鹽酸多柔比星組、聯(lián)合用藥組細胞周期位于G0/G1期和S期的比例增多，位于G2/M期的比例減少，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0．05);與聯(lián)合用藥組比較，QHF復方組、鹽酸多柔比星組細胞周期位于G0/G1期的比例減少，位于S期和G2/M期的比例增多，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0．05，見表2)。

表2 不同組人乳腺癌MCF-7細胞不同細胞周期所占比例比較(± s，%)Table 2 Comparison of different cell cyclesofhuman breast cancer cell line MCF-7 in different groups

表2 不同組人乳腺癌MCF-7細胞不同細胞周期所占比例比較(± s，%)Table 2 Comparison of different cell cyclesofhuman breast cancer cell line MCF-7 in different groups

注:與正常對照組比較，*P＜0．05;與聯(lián)合用藥組比較，△P＜0．05

組別 例數(shù) G0/G1期 S期 G2/M期正常對照組 3 3．9 ±0．25 9．7 ±0．36 86．4 ±4．68 QHF 復方組 3 43．5 ±1．32＊△ 34．9 ±3．17＊△ 21．6 ±1．80＊△鹽酸多柔比星組 3 43．1 ±3．80＊△ 35．1 ±1．96＊△ 21．8 ±2．69＊△聯(lián)合用藥組 3 56．6 ±3．14* 32．9 ±1．60* 10．5 ±2．27*F 0．000 0．000 0．000 238．234 110．256 383．572 P值值

2．3 中藥QHF復方對MCF-7細胞上清液中VEGF含量的影響 ELISA結(jié)果顯示:作用48 h后，與正常對照組比較，QHF1組、QHF2組、QHF3組、QHF4組和QHF5組上清液中VEGF含量均下降，差異有統(tǒng)計學意義 (F=238．234，P＜0．05，見圖 2)。

2．4 中藥QHF復方對MCF-7細胞遷移及侵襲能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示:QHF1組、QHF2組對細胞的抑制作用較大，使穿膜的細胞數(shù)顯著減少，對Transwell實驗結(jié)果影響較大，選取QHF3組、QHF4組和QHF5組3個抑制作用相對較低的濃度進行實驗。與正常對照組 (127．3±5．7)比較，QHF3組 (17．7 ±5．0)、QHF4 組 (51．3 ±2．9)和 QHF5 組(63．0±6．6)穿透濾膜的MCF-7細胞數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計學意義 (F=109．667，P ＜0．01，見圖3)。

圖1 中藥QHF復方對MCF-7細胞的生長抑制率Figure 1 Growth-inhibiting effect of compound QHF on MCF-7 cells

圖2 ELISA法檢測上清液中VEGF的表達Figure 2 Expression of VEGF determined by ELISA

圖3 中藥QHF復方對MCF-7細胞侵襲能力的影響 (結(jié)晶紫染色，光鏡，×200)Figure 3 Effect of compound QHF on MCF-7 cell invasion determined by crystal violet staining

3 討論

乳腺癌是導致婦女死亡最常見的惡性腫瘤之一，容易早期發(fā)生血行播散，對女性健康威脅極大。目前，乳腺癌的治療措施有外科手術、化療、放療、靶向生物治療等，對大多數(shù)乳腺癌細胞有一定的殺傷作用，但仍有25%～30%的早期乳腺癌患者在隨訪10～15年之后發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移［3］。同時腫瘤細胞的耐藥性及化療藥物的毒副作用也是腫瘤治療過程中的另一難題，因此動、植物來源的天然化合物已經(jīng)成為抗癌藥物的主要研究方向。目前中藥復方仍是中醫(yī)藥防治腫瘤的主流，其多成分、多環(huán)節(jié)和多靶點整體調(diào)節(jié)的特點對于多基因調(diào)控、發(fā)病機制復雜、病情多變的腫瘤防治來說具有非常重要的意義。且中藥又因其獨特的抗腫瘤效應、放化療增敏以及減輕放化療毒副作用及延長患者生存期等方面獨具效果而逐漸被重視［4-6］。因此，本實驗的目的就是探討中藥QHF復方在體外對人乳腺癌MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲及VEGF表達的影響，從而為乳腺癌的臨床治療奠定基礎。

中藥QHF復方是由華蟾素、人參皂苷Rg3、三七總皂苷、香菇多糖以一定比例配伍而成，其中華蟾素與人參皂苷Rg3在復方中占主導地位［7］。華蟾素注射液由中華大蟾蜍皮經(jīng)過水化萃取、加工而成，美國已經(jīng)完成華蟾素注射液Ⅰ期抗腫瘤的臨床試驗，目前正在進行華蟾素注射液的Ⅱ期抗腫瘤臨床試驗［8］。研究表明華蟾素能抑制HepG-2細胞的增殖并呈濃度依賴性，還能阻滯腫瘤細胞周期［9］，本研究 MTT實驗結(jié)果顯示不同濃度的中藥QHF復方均能抑制人乳腺癌MCF-7細胞的增殖，且隨著藥物濃度的增大及作用時間的延長，其對MCF-7細胞的生長抑制率也隨之增大;流式細胞儀結(jié)果顯示，QHF復方組細胞周期位于G0/G1期和S期的比例增多，位于G2/M期的比例減少。人參皂苷Rg3是一種四環(huán)三萜皂苷，是從中藥人參根的浸出液中分離出來的一種有效單體成分，其抗腫瘤作用已經(jīng)引起了廣泛重視，但確切機制尚未明了。有研究證實人參皂苷Rg3能抑制動物體內(nèi)多種移植瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移，且對重要臟器無明顯毒副作用［10］。本研究通過Transwell實驗表明，中藥QHF復方能降低MCF-7細胞的遷移和侵襲能力，且呈現(xiàn)較好的濃度依賴性。研究結(jié)果表明QHF復方有抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲的能力，與現(xiàn)有的研究報道結(jié)果相符［11］。

乳腺癌患者死亡的主要原因是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，而導致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的一個重要因素是腫瘤新生血管的形成。已經(jīng)證實VEGF是目前發(fā)現(xiàn)最重要的直接作用于血管內(nèi)皮的生長因子［12］。VEGF是由腫瘤細胞分泌進入體液，其能特異性地對血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和細胞外基質(zhì)的降解及血管構(gòu)建等方面進行調(diào)控。研究表明，無論是在mRNA水平還是蛋白水平，在多種惡性腫瘤中VEGF的表達均增高，而抑制VEGF的表達可抑制腫瘤的生長［13］。因此探討中藥QHF復方對人乳腺癌MCF-7細胞VEGF表達的影響對研究中藥QHF復方抗腫瘤的具體機制有重要意義。本研究結(jié)果表明，中藥QHF復方能降低人乳腺癌MCF-7細胞上清液中VEGF含量，提示中藥QHF復方抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲的作用的可能與其抑制腫瘤細胞VEGF的分泌和合成有關。目前，對中藥抗腫瘤血管生成研究主要圍繞中藥對腫瘤新生血管形成的影響及抑制VEGF/血管內(nèi)皮細胞生長因子受體 (VEGFR)相關信號通路展開［14］，但其調(diào)控信號傳導從細胞外經(jīng)細胞膜及細胞質(zhì)到細胞核而發(fā)揮效應的具體機制和環(huán)節(jié)尚需進一步的研究證實，也是本課題今后研究的方向之一。

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