倪曉辰，陳硯凝，武新慧，張愛(ài)莉，趙志紅

膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)膀胱癌的發(fā)病率呈顯著增加趨勢(shì)。膀胱癌的治療目前仍以手術(shù)治療為主，但是由于膀胱癌術(shù)后極易復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)后腫瘤具有向更高級(jí)別惡性程度發(fā)展的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后，為膀胱癌的臨床治療帶來(lái)極大挑戰(zhàn)，所以研究預(yù)防其復(fù)發(fā)的理想藥物具有重大的臨床意義。去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin,DMC)對(duì)人膀胱癌的作用尚不清楚。本研究觀察了DMC對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并初步探討了其誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究DMC治療膀胱癌提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物準(zhǔn)備 人膀胱癌T24細(xì)胞株用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%融合后，用消化液〔含0.25%胰蛋白酶、0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸鹽緩沖液(PBS)〕消化傳代，至細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將DMC粉末充分溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，制備成濃度為160 μM的儲(chǔ)液，等分裝10份后置于-20 ℃避光保存?zhèn)溆?。將?xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入不同濃度的DMC進(jìn)行孵育，對(duì)照組加入等體積DMSO進(jìn)行孵育。

1.2 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)實(shí)驗(yàn) 將T24細(xì)胞用消化液消化，并吹打成單細(xì)胞懸液，并將約100 μl的細(xì)胞懸液(約1×104個(gè)細(xì)胞)接種于96孔板各孔中，貼壁后實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的DMC(10、20、40、80、160 μM)刺激48 h。對(duì)照組使用0.1%(體積比)的DMSO孵育相同時(shí)間。倒置顯微鏡觀察后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，并于37 ℃下孵育3 h，然后棄去培養(yǎng)液，每孔各加入DMSO 150 μl，混勻后于570 nm處比色測(cè)定。以上各組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.3 流式細(xì)胞學(xué)分析 將各組細(xì)胞用消化液徹底消化并吹打成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min,離心半徑為16 cm。用PBS漂洗數(shù)次后，將細(xì)胞重懸在500 μl結(jié)合緩沖液中，之后各組加入5 μl的Annexin V 和 10 μl的碘化丙啶(PI)。染色后用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。細(xì)胞凋亡采用Annexin V/ PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 Western印跡分析 采用Western印跡法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)(Santa cruz)、細(xì)胞周期抑制蛋白p27(cell signaling)、Caspase 3(cell signaling)及其底物多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)(cell signaling)、p-mTOR(Ser2448)/mTOR(cell signaling)等蛋白的變化。采用凝膠成像分析軟件Quantity One對(duì)待測(cè)條帶的灰度與內(nèi)參照(β-actin)條帶灰度的比值進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 DMC抑制T24細(xì)胞增殖 MTT顯示，實(shí)驗(yàn)組用不同濃度的DMC孵育48 h后，細(xì)胞增殖活力均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖1)。Western印跡法顯示，用不同濃度的DMC(20、40、80 μM)處理T24細(xì)胞48 h，PCNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，p27相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)；且隨DMC濃度的增加PCNA相對(duì)表達(dá)量逐漸減低，p27相對(duì)表達(dá)量逐漸增高。

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05,△P<0.01

圖1 不同濃度DMC對(duì)T24 細(xì)胞增殖活力的影響

Figure1 Effects of different concentrations of DMC on the proliferation of T24 cells

2.2 DMC誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同濃度DMC(20、40、80 μM)處理T24細(xì)胞48 h后，細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡，細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖2)。Western印跡法顯示，不同濃度DMC(20、40、80 μM)處理T24細(xì)胞48 h后，pro-caspase 3、cleaved-caspase 3、pro-PARP、cleaved-PARP的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

Table1 Comparison of relative expression of PCNA and p27 in control group and different concentrations DMC groups

組別PCNAp27對(duì)照組1 00±0 101 00±0 0820μM組0 81±0 02?1 96±0 14?40μM組0 57±0 03?△3 48±0 16?△80μM組0 42±0 03?△▲5 31±0 09?△▲F值69 80697 40P值<0 05<0 05

注：PCNA=增殖細(xì)胞核抗原；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與20 μM組比較，△P<0.05；與40 μM組比較，▲P<0.05

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

圖2 不同濃度DMC對(duì)T24細(xì)胞凋亡率的影響

Figure2 Effects of different concentrations of DMC on apoptosis in T24 cells

Table2 Comparison of relative expression of pro-caspase 3,cleaved-caspase 3,pro-PARP and cleaved-PARP in control group and different concentrations DMC groups

組別pro-caspase3cleaved-caspase3pro-PARPcleaved-PARP對(duì)照組1 00±0 041 00±0 131 00±0 051 00±0 0520μM組1 01±0 063 35±0 22?0 97±0 051 02±0 0140μM組0 82±0 03?4 47±0 15?0 90±0 214 55±0 29?80μM組0 25±0 05?6 37±0 15?0 73±0 04?5 10±0 21?F值198 5546 826 9442 4P值<0 05<0 05<0 05<0 05

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3 DMC抑制mTOR的活化 用濃度為40 μM的DMC分別刺激T24細(xì)胞0、15、30、60和120 min，采用Western印跡法檢測(cè)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的mTOR通路磷酸化的變化顯示，不同時(shí)間點(diǎn)p-mTOR的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且刺激30、60、120 min時(shí)的p-mTOR的相對(duì)表達(dá)量均低于0 min時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同時(shí)間點(diǎn)mTOR的相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表3)。

Table3 Comparison of relative expression of p-mTOR ang mTOR in different times

時(shí)間(min)p-mTORmTOR01 00±0 01 1 00±0 05151 00±0 02 1 00±0 05300 79±0 03?0 99±0 04600 77±0 04?1 00±0 031200 37±0 03?0 97±0 04F值305 600 27P值<0 05>0 05

注：與0 min比較，*P<0.05

3 討論

多年來(lái)，膀胱癌一直是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),且復(fù)發(fā)率高[1]。膀胱癌術(shù)后常用膀胱灌注化學(xué)藥物預(yù)防復(fù)發(fā)，但效果不甚理想且局部反應(yīng)較大。研究證實(shí)，姜黃素對(duì)于膀胱癌、前列腺癌、結(jié)腸癌及乳腺癌等多種腫瘤均具有抑制性[2-3]，能夠顯著減少腫瘤細(xì)胞數(shù),縮小腫瘤細(xì)胞體積。但姜黃素對(duì)膀胱癌的作用尚不清楚。

DMC作為姜黃素的結(jié)構(gòu)類似物，也同樣具有抗腫瘤效應(yīng)[4]，可強(qiáng)烈抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖[5]。其穩(wěn)定性較傳統(tǒng)姜黃素更強(qiáng)，能夠顯著延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間和體內(nèi)t1/2。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組用不同濃度的DMC孵育48 h后，細(xì)胞增殖活力均低于對(duì)照組，提示DMC能夠顯著抑制T24細(xì)胞的增殖活力，且具有劑量及時(shí)間依賴性。PCNA參與DNA的合成過(guò)程，是常用的細(xì)胞增殖標(biāo)志物，該蛋白的表達(dá)量與細(xì)胞的增殖狀態(tài)密切相關(guān)[6]。p27是細(xì)胞周期抑制物，在增殖活躍的細(xì)胞中，該蛋白表達(dá)量下調(diào)，并成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，用不同濃度的DMC(20、40、80 μM)處理T24細(xì)胞48 h，PCNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，p27相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組；且隨DMC濃度的增加PCNA相對(duì)表達(dá)量逐漸減低，p27相對(duì)表達(dá)量逐漸增高，提示DMC能夠下調(diào)PCNA的表達(dá)量，上調(diào)p27表達(dá)量。因此，推測(cè)DMC抑制T24細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與該化合物下調(diào)PCNA及上調(diào)p27的表達(dá)量有關(guān)。

誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物作用的重要機(jī)制之一。姜黃素可以通過(guò)Caspase非依賴性方式誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在DMC處理的T24細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，且隨給藥濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。Caspase 3是Caspase凋亡途徑中的主要執(zhí)行者，前體Caspase 3被剪切后形成有功能的剪切體[9]。PARP是Caspase 3的底物，其與DNA修復(fù)等有關(guān)，當(dāng)Caspase 3激活后，PARP即被剪切，從而發(fā)揮功能[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度DMC(20、40、80 μM)處理T24細(xì)胞48 h后，pro-caspase 3、cleaved-caspase 3、pro-PARP、cleaved-PARP的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較有明顯差異，由于有活性的Caspase 3剪切體表達(dá)量增加，該酶的底物PARP剪切體表達(dá)量也顯著增加，因此DMC誘導(dǎo)的T24細(xì)胞凋亡可能與該化合物誘導(dǎo)激活Caspase 3依賴的凋亡通路有關(guān)。mTOR通路在腫瘤增殖與生長(zhǎng)、維持代謝與穩(wěn)態(tài)、參與凋亡與自噬等多種生物學(xué)過(guò)程中起到重要作用[10]。本研究還發(fā)現(xiàn)，用濃度為40 μM的DMC分別刺激T24細(xì)胞0、15、30、60、120 min，采用Western印跡法檢測(cè)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的mTOR通路磷酸化的變化顯示，不同時(shí)間點(diǎn)p-mTOR的相對(duì)表達(dá)量有明顯差異，且刺激30、60、120 min時(shí)的p-mTOR的相對(duì)表達(dá)量均低于0 min時(shí)；不同時(shí)間點(diǎn)mTOR的相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異。說(shuō)明在給予DMC(40 μM)刺激30 min后，可顯著抑制mTOR的磷酸化水平，因此DMC可能通過(guò)抑制mTOR的磷酸化而發(fā)揮對(duì)膀胱癌的抑制作用，提示DMC抑制T24細(xì)胞增殖的分子機(jī)制可能與抑制mTOR通路活化有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DMC可通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)對(duì)膀胱癌細(xì)胞發(fā)揮顯著的抗腫瘤活性，對(duì)于臨床上膀胱癌的治療有較廣闊的應(yīng)用價(jià)值，為今后開(kāi)發(fā)新一代抗腫瘤藥物提供了新的思路。然而DMC在動(dòng)物體內(nèi)是否也同樣有類似的抗腫瘤效果仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

1 吳階平.吳階平泌尿外科學(xué) [M].山東:山東科學(xué)技術(shù)出版社,2004:965-966.

2 Teiten MH,Gaascht F,Cronauer M,et al.Anti-proliferative potential of curcumin in androgen-dependent prostate cancer cells occurs through modulation of the wingless signaling pathway[J].Int J Oncol,2011,38(3):603-611.

3 Lee YK,Park SY,Kim YM,et al.Regulatory effect of the AMPK-COX-2 signaling pathway in curcumin-induced apoptosis in HT-29 colon cancer cells[J].Ann N Y Acad Sci,2009,1171:489-494.

4 Yodkeeree S,Ampasavate C,Sung B,et al.Demethoxycurcumin suppresses migration and invasion of MDA-MB-231 human breast cancer cell line[J].Eur J Pharmacol,2010,627(1/3):8-15.

5 Ni X,Zhang A,Zhao Z,et al.Demethoxycurcumin inhibits cell proliferation,migration and invasion in prostate cancer cells[J].Oncol Rep,2012，28(1):85-90.

6 López de Saro FJ.Regulation of interactions with sliding clamps during DNA replication and repair[J].Curr Genomics,2009,10(3):206-215.

7 He W,Wang X,Chen L，et al.A crosstalk imbalance betwee p27(Kip1) and its interacting molecules enhances breast carcinogenesis[J].Cancer Biother Radiopharm,2012，27(7):399-402.

8 Hilchie AL,Furlong SJ,Sutton K,et al.Curcumin-induced apoptosis in PC3 prostate carcinoma cells is caspase-independent and involves cellular ceramide accumulation and damage to mitochondria[J].Nutr Cancer,2010，62(3):379-389.

9 Cohen GM.Caspases:the executioners of apoptosis[J].Biochem J,1997，326(Pt 1):1-16.

10 Polivka J Jr,Janku F.Molecular targets for cancer therapy in the PI3K/AKT/mTOR pathway [J].Pharmacol Ther，2014，142(2):164-175.