陳 琰，高依依，李占園，葉菡洋，鄭 育，周志宏

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)是日本學(xué)者Nishimura等[1]于2000年發(fā)現(xiàn)的纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族中的新成員，已有研究證實(shí)FGF21在腎臟組織中有表達(dá)，但迄今為止FGF21的確切生物活性及其作用機(jī)制仍了解甚少[2]。本研究通過(guò)觀察慢性腎臟病(CKD)患者外周血中FGF21的表達(dá)差異，并構(gòu)建CKD動(dòng)物模型以觀察FGF21干預(yù)后其腎臟功能和病理改變，以期初步探討FGF21在CKD中的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 臨床研究 選取2012年在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院就診的CKD患者200例，均簽署知情同意書(shū)。其中男129例，女71例；平均年齡為(50.2±17.1)歲。根據(jù)估算腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)，公式為eGFR =175×〔肌酐(mg/dl)〕-1.234×〔年齡(歲)〕-0.179×性別(男性=1，女性=0.79)，按照《慢性腎臟病及透析的臨床實(shí)踐指南》(K/DOQI指南)中CKD診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者進(jìn)行分組：CKD1～2期組(76例)、CKD3～4期組(56例)和CKD5期組(68例)。另選取本院同期體檢證實(shí)血、尿常規(guī)，肝、腎功能，血電解質(zhì)，血脂等均在參考范圍內(nèi)的健康成人40例為對(duì)照組，其中男26例，女14例；平均年齡為(49.5±12.3)歲。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)研究 清潔級(jí)雄性8周齡C57BL/6小鼠36只，體質(zhì)量22～24 g，購(gòu)自北京唯通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(動(dòng)物合格證號(hào)0300740)。小鼠飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度(55±2)%，定時(shí)日光燈照射12 h/d，房間保持通風(fēng)、恒溫、安靜，定期更換墊料，清洗籠具。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)完全隨機(jī)化分組，分為正常對(duì)照組(C組)、模型組(M組)、低劑量FGF21干預(yù)組(M+L組)和高劑量FGF21干預(yù)組(M+H組)，每組9只。給予M組、M+L組、M+H組腺嘌呤混懸液灌胃(第1周及第2～4周給藥劑量分別為250 mg/kg和125 mg/kg，均為每2 d給藥1次，上午給藥)，C組給予等量蒸餾水灌胃。M+L組、M+H組在腺嘌呤混懸液灌胃的基礎(chǔ)上給予FGF21腹腔注射(劑量分別為100 μg/kg和400 μg/kg，均每天上午給藥)，C組、M組給予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。

1.2 主要試劑及藥品 腺嘌呤購(gòu)自上海Sigma公司(批號(hào)SLBC1727V)；FGF21免疫組化試劑盒為美國(guó)Abcom公司生產(chǎn)；FPG21由溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供。

1.3 方法

1.3.1 臨床研究 收集CKD患者的一般資料，包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)及既往病史。體檢健康者和CKD患者均空腹至少10 h，然后取外周血標(biāo)本8.0 ml。將2.5 ml外周血分離血清，按0.2 ml等份分裝，-80 ℃低溫保存。將分離的血樣一份送臨床檢驗(yàn)室，采用日立7600全自動(dòng)儀進(jìn)行各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)(化學(xué)試劑法測(cè)定)，包括空腹血糖、空腹胰島素、血脂(三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白)、清蛋白、肌酐、尿素氮、尿酸、脂聯(lián)素和FGF21，計(jì)算eGFR。血清脂聯(lián)素(R&D，美國(guó))、FGF21(Biovendor，Modrice，捷克)均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定，其測(cè)定原理及操作步驟按所購(gòu)試劑盒相關(guān)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)研究 觀察小鼠給藥期間的身體狀況及活動(dòng)情況，每天記錄攝食量及體質(zhì)量變化。(1)造模4周后處死小鼠，摘除小鼠眼球取血，血標(biāo)本室溫下2 000 r/min離心10 min，然后取上層血清，用日立7600全自動(dòng)儀測(cè)定其中肌酐、尿素氮、尿酸、清蛋白及FGF21水平。(2)光鏡下腎組織形態(tài)學(xué)觀察：造模4周后解剖小鼠并取出雙側(cè)腎臟，經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋，切片厚度為3 μm，采用HE染色及Massion染色法觀察腎組織病理變化。(3)免疫組化檢測(cè)腎組織FGF21：石蠟包埋后制片，切片厚度為3 μm，采用鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(SABC法)進(jìn)行免疫組化染色，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。200倍鏡下每張切片隨機(jī)找出10個(gè)不重疊視野，用醫(yī)學(xué)圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0半定量分析，以每個(gè)高倍鏡視野下陽(yáng)性表達(dá)的積分吸光度(A)表示FGF21的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 臨床研究結(jié)果

2.1.1 受檢者一般資料及生化指標(biāo)比較 對(duì)照組和CKD各期患者年齡、女性比例、BMI、空腹血糖、低密度脂蛋白水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而4組空腹胰島素、三酰甘油、高密度脂蛋白、清蛋白、血肌酐、尿素氮、血尿酸、脂聯(lián)素、FGF21水平及eGFR比較，CKD各期糖尿病發(fā)生率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；組間兩兩比較：CKD各期患者三酰甘油、血尿酸水平均高于對(duì)照組，清蛋白水平低于對(duì)照組；CKD3～4期組、CKD5期組患者空腹胰島素水平高于對(duì)照組及CKD1～2期組，而eGFR低于對(duì)照組和CKD1～2期組，且CKD5期組患者eGFR亦低于CKD3～4期組；CKD5期組患者高密度脂蛋白水平低于對(duì)照組，而脂聯(lián)素水平高于對(duì)照組；對(duì)照組、CKD1～2期組、CKD3～4期組、CKD5期組血肌酐、尿素氮、FGF21水平依次增加，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1、圖1)。

所有受檢者中，男155例，女85例，男性血清FGF21水平與女性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(826.3±100.4)ng/L與(789.6±86.5)ng/L，t=0.556，P=0.470〕。CKD患者中，合并糖尿病者68例，非糖尿病者132例，二者血清FGF21水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(1 253.0±170.1)ng/L與(714.0±82.1)ng/L，t=3.125，P=0.002〕。

2.1.2 CKD組患者血清FGF21與各臨床指標(biāo)間的相關(guān)性 通過(guò)對(duì)年齡、性別、BMI、糖尿病校正后，相關(guān)分析顯示血清FGF21水平與三酰甘油、血肌酐、尿素氮、脂聯(lián)素呈正相關(guān)(P<0.05)，與低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、eGFR呈負(fù)相關(guān)(P<0.05，見(jiàn)表2)。

2.2 實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果

2.2.1 小鼠體質(zhì)量及血生化指標(biāo)變化 可觀察到在同一時(shí)間點(diǎn)，相較于C組，M組小鼠稍萎靡、體質(zhì)量下降，活動(dòng)量減少；M+L組和M+H組小鼠體質(zhì)量較M組下降更明顯，尤其是M+H組小鼠萎靡、體毛干枯不齊，體質(zhì)量下降最顯著(見(jiàn)圖2)。造模后M組小鼠血肌酐、尿素氮、血尿酸水平較對(duì)照組升高，提示本實(shí)驗(yàn)造模成功。

表1 各組受檢者臨床資料和生化指標(biāo)的比較

注：BMI=體質(zhì)指數(shù)，F(xiàn)GF21=成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21，eGFR=估算腎小球?yàn)V過(guò)率；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與CKD1～2期組比較，△P<0.05；與CKD3～4期組比較，▲P<0.05；☆為χ2值；-表示無(wú)數(shù)據(jù)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與CKD1～2期組比較，△P<0.05；與CKD3～4期組比較，▲P<0.05

圖1 各組患者血清FGF21水平的比較

Figure1 Comparison of serum FGF21 concentration among different patient groups

表2 血清FGF21水平與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

注：*表示對(duì)年齡、性別、BMI、糖尿病校正后行Pearson相關(guān)分析；-表示無(wú)數(shù)據(jù)

M組、M+L組、M+H組小鼠清蛋白水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而3組血肌酐、尿素氮、血尿酸水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中，與M組比較，F(xiàn)GF21干預(yù)后小鼠血肌酐、尿素氮、血尿酸水平升高，且M+H組上述3項(xiàng)腎功能指標(biāo)較M+L組惡化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3)。

2.2.2 各組小鼠光鏡下腎組織病理改變 HE染色及Massion染色結(jié)果顯示，M組小鼠部分腎小球系膜區(qū)細(xì)胞增生，基質(zhì)增多，部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性，腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；FGF21干預(yù)后，腎臟病理?yè)p傷面積及程度加重，M+H組小鼠腎小球部分萎縮，腎小管擴(kuò)張變形并萎縮明顯，部分腎間質(zhì)彌漫炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，亦可見(jiàn)蛋白、細(xì)胞管型(見(jiàn)圖3)。

2.2.3 免疫組化檢測(cè)各組小鼠腎組織中FGF21的表達(dá) 與C組比較，M組小鼠腎組織中FGF21表達(dá)明顯升高；FGF21干預(yù)后，當(dāng)FGF21干預(yù)劑量增加時(shí)，腎組織中FGF21表達(dá)亦升高(見(jiàn)圖4)。

圖2 各組小鼠體質(zhì)量變化

表3 各組小鼠腎功能指標(biāo)比較

注：與M組比較，*P<0.05；與M+L組比較，△P<0.05

3 討論

近年來(lái)雖然對(duì)腎臟疾病的認(rèn)識(shí)有了迅速的進(jìn)展，但在發(fā)病機(jī)制及易患因素方面仍所知甚少，已經(jīng)確認(rèn)的是腎小球疾病多為免疫介導(dǎo)炎癥性疾病或代謝異常所致疾病[3]。近期的研究證實(shí)FGF21具有內(nèi)分泌因子的功能，參與機(jī)體物質(zhì)代謝，維持機(jī)體內(nèi)脂糖代謝的平衡。當(dāng)前有限的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究主要是集中體現(xiàn)FGF21在體內(nèi)脂糖代謝調(diào)控方面的作用[4-5]。目前已證實(shí)FGF21在腎臟中有表達(dá)，但在CKD的進(jìn)展中其表達(dá)的變化及作用機(jī)制尚不清楚，值得研究。

目前，最新的研究?jī)H顯示在長(zhǎng)期血液透析患者也就是腎功能嚴(yán)重受損的患者中，F(xiàn)GF21水平顯著增加[6]。本研究也顯示CKD5期患者血清FGF21水平明顯上升，并顯著高于CKD1～2期和CKD3～4期患者；同時(shí)血清FGF21水平還與eGFR呈負(fù)相關(guān)，與血肌酐、尿素氮呈正相關(guān)，提示隨著CKD患者的疾病進(jìn)展，血清FGF21水平逐漸增高。故推斷隨著腎功能的惡化，血清FGF21生理水平會(huì)相應(yīng)調(diào)節(jié)。并且本研究觀察到CKD1～2期患者血清FGF21水平已開(kāi)始升高，隨著eGFR的下降呈進(jìn)行性遞增，故認(rèn)為FGF21可能是一個(gè)敏感的提示腎功能變化的生物學(xué)標(biāo)志物。但是FGF21在CKD患者中體內(nèi)表達(dá)增加的意義尚未明確，其水平升高是抵抗腎功能惡化的一種適應(yīng)性反應(yīng)，還是在腎功能惡化過(guò)程中起推動(dòng)因素的因子，是本研究下一個(gè)需要解答的問(wèn)題。

圖3 4組小鼠光鏡下腎組織病理改變(HE，×100)

Figure3 The pathological change of renal tissue in 4 rat groups under light microscope

圖4 4組小鼠腎組織FGF21表達(dá)(免疫組化，×200)

Figure4 The expression of FGF21 in renal tissues of 4 rat groups

故在實(shí)驗(yàn)研究中，建立CKD動(dòng)物模型，并給予不同劑量的FGF21干預(yù)。結(jié)果顯示，高劑量FGF21干預(yù)的小鼠血清和腎組織中FGF21的表達(dá)均增加，且小鼠出現(xiàn)腎功能惡化及腎臟病理顯著損傷，故提出假設(shè)——FGF21在腎臟病變中可能為損傷因子，其高濃度表達(dá)反而促進(jìn)腎單位損傷加重。有研究顯示，在高血壓患者中FGF21也呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[7]，故懷疑FGF21是否與腎小球囊內(nèi)高壓有一定相關(guān)性。目前，隨著對(duì)FGF21研究深入，已顯示FGF21可能是作為一個(gè)自分泌/旁分泌細(xì)胞因子發(fā)揮作用[8]，故有理由相信FGF21可能通過(guò)多途徑影響了腎臟功能代謝，其具體的作用機(jī)制仍不明確，也值得繼續(xù)深入研究。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)合并糖尿病的CKD患者血清FGF21水平顯著高于非糖尿病CKD患者，血清FGF21水平與三酰甘油、脂聯(lián)素呈正相關(guān)，證實(shí)了FGF21在機(jī)體內(nèi)糖脂代謝方面起積極作用[9]。

綜上所述，隨著腎功能的惡化，血清FGF21水平逐漸升高，并且FGF21高表達(dá)可能進(jìn)一步促進(jìn)腎單位損傷。近年來(lái)已有研究者致力于實(shí)現(xiàn)人源FGF21的高效表達(dá)[10]，因此，揭示FGF21在CKD發(fā)病機(jī)制中作用值得進(jìn)一步研究，同時(shí)為早期診治CKD提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

1 Nishimura T，Nakatake Y，Konishi M，et al.Identification of a novel FGF，F(xiàn)GF-21，preferentially expressed in the liver[J].Biochim Biophys Acta，2000，1492(1)：203-206.

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3 Filiopoulos V，Vlassopoulos D.Inflammatory syndrome in chronic kidney disease：pathogenesis and influence on outcomes[J].Inflamm Allergy Drug Targets，2009，8(5)：369-382.

4 Wente W，Efanov AM，Brenner M，et al.Fibroblast growth factor-21 improves pancreatic beta-cell function and survival by activation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 and Akt signaling pathways[J].Diabetes，2006，55(9)：2470-2478.

5 Kharitonenkov A，Shanafelt AB.FGF21：a novel prospect for the treatment of metabolic diseases[J].Curr Opin Investig Drugs，2009，10(4)：359-364.

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7 Semba RD，Crasto C，Strait J，et al.Elevated serum fibroblast growth factor 21 is associated with hypertension in community-dwelling adults[J].Hum Hypertens，2013，27(6)：397-399.

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