周 瑩，劉 沛

感染性休克是由病原微生物及其毒素或抗原-抗體復(fù)合物引起的以急性微循環(huán)障礙為主要表現(xiàn)的一組臨床綜合征。主要血流動力學(xué)改變包括低血壓、低外周血管阻力、血管對收縮劑反應(yīng)性下降、血流重新分布等[1]，是由腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素1(IL-1)、血小板活化因子(PAF)、花生四烯酸代謝產(chǎn)物〔前列環(huán)素(PG)、白三烯(LT3)、血栓素A2(TXA2)〕、一氧化氮(NO)等多種因子共同作用的結(jié)果[2]。多項動物實驗證實，TNF-α是引起感染性休克、多器官功能衰竭(MOF)的主要遞質(zhì)[3]。有證據(jù)表明TNF-α可通過多種途徑間接參與心肌細胞、血管平滑肌細胞(VSMC)和支氣管平滑肌細胞的收縮[4]。感染性休克中血流動力學(xué)的改變與血管的收縮、舒張能力變化有關(guān)，為了探討TNF-α在感染性休克血管收縮性變化中的作用，本實驗試圖在器官及細胞水平上應(yīng)用TNF-α預(yù)處理離體去內(nèi)皮主動脈環(huán)，觀察其在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作用下的收縮反應(yīng)，并分離培養(yǎng)VSMC，經(jīng)TNF-α預(yù)處理后觀察細胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的變化，探討TNF-α影響VSMC功能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠60只(中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，體質(zhì)量200～250 g；乙酰甲酯(Fluo-3/AM)、AngⅡ、乙酰膽堿(Sigma公司)；TNF-α(R&D公司)；2-氨基乙氧基聯(lián)苯硼酸鹽(2-APB，Merck公司)；兔抗α-肌動蛋白單克隆抗體、TRITC標記山羊抗兔IgG抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司)；DMEM培養(yǎng)液、標準胎牛血清(Gibco公司)；25 cm2培養(yǎng)瓶、3.5 cm薄底平皿(Corning公司)；乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、TritonX-100、氯化鈣(CaCl2)等化學(xué)試劑(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司)。

張力傳導(dǎo)放大器(TB-611T，Nihon Kohden公司)；激光共聚焦顯微鏡及LSM510軟件(德國Carl Zeiss公司)。實驗時間為2012年3—6月，地點為中國醫(yī)科大學(xué)中心實驗室。

1.2 方法

1.2.1 離體主動脈環(huán)制備及反應(yīng)性測定

1.2.1.1 離體主動脈環(huán)制備 選取24只Wistar大鼠，采用45%烏拉坦和5%氯醛糖混合液1 ml腹腔注射使大鼠致死，開胸取胸主動脈置于通有95%氧氣(O2)和5%二氧化碳(CO2)的Kreb液中，分離周圍的脂肪和結(jié)締組織后剪成數(shù)個長3～5 mm的主動脈環(huán)，用內(nèi)皮摩擦法去除內(nèi)皮。將制備好的主動脈環(huán)垂直懸掛于裝有Kreb液的浴槽中(pH 7.4，以95%O2和5%CO2的混合氣持續(xù)通氣)，基礎(chǔ)張力1.2 g平衡45 min(每隔15 min換液)，給予40 mmol/L氯化鉀(KCl)使主動脈環(huán)收縮，收縮幅度>0.6 g。在收縮頂峰時給予10-6mol/L乙酰膽堿(檢驗有無內(nèi)皮，如舒張幅度大于30%認為內(nèi)皮完整，如無舒張則為去內(nèi)皮)，無舒張的標本留用。留用標本沖洗后重復(fù)給予40 mmol/L KCl直至前后連續(xù)2次得到的收縮幅度之差小于0.1 g的標本進行下一步實驗。

1.2.1.2 實驗分組和給藥 留用的主動脈環(huán)在給予KCl后每隔15 min換液1次，平衡30 min后隨機分為4組：去內(nèi)皮對照組(浴槽液為Kreb液)、去內(nèi)皮TNF-α組(浴槽液為含5 μg/L TNF-α的Kreb液)、去內(nèi)皮無鈣對照組(浴槽液為無鈣的Kreb液)和去內(nèi)皮無鈣TNF-α組(浴槽液為含5 μg /L TNF-α的無鈣的Kreb液)，每組6只。各組主動脈環(huán)在孵育1 h后給予10-7mol/L(終濃度)AngⅡ，記錄收縮幅度。

1.2.2 原代培養(yǎng)VSMC及其內(nèi)[Ca2+]i測定

1.2.2.1 改進的原代VSMC培養(yǎng)及鑒定 參照Chamley-Campbell等[5]歸納的VSMC培養(yǎng)方法。無菌取出3只Wistar大鼠胸主動脈，用0.9%氯化鈉注射液沖洗5遍。剝?nèi)ネ饽?，縱向剖開血管。用0.25%胰蛋白酶室溫消化內(nèi)膜2～3 min，加入2～3 ml含20%胎牛血清的DMEM終止消化。然后刮去內(nèi)膜，將留下的中膜切成1 mm2大小的組織碎塊，間隔0.5 cm置于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37 ℃ 5%CO2孵箱中2～4 h，加入5 ml含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。3～7 d可見組織塊邊緣出現(xiàn)新生細胞，細胞生長融合后傳代。在光鏡下進行形態(tài)鑒定，用抗α-肌動蛋白抗體熒光染色鑒定細胞及純度。

1.2.2.2 VSMC的準備及分組 把生長穩(wěn)定的第4～12代VSMC隨機分為對照組(正常細胞30個)、TNF-α組(加入TNF-α后孵育8 h的細胞27個)；另設(shè)上述2組于加AngⅡ前10 min加入2-APB，即2-APB拮抗對照組和2-APB拮抗TNF-α組，各30個細胞。預(yù)實驗2-APB濃度為20、40、80、100 μmol/L，本實驗采用具有完全阻斷效應(yīng)的最低濃度40 μmol/L。

1.2.2.3 VSMC內(nèi)[Ca2+]i測定[6]培養(yǎng)液中加入Fluo-3/AM(終濃度為5 μmol/L)，37 ℃CO2培養(yǎng)箱中避光負載45 min，Hank′s液洗去細胞外液中殘余的Fluo-3/AM，加無鈣D-Hank′s緩沖液1 ml后，采用confocal顯微鏡測定單個活細胞內(nèi)Ca2+熒光強度(發(fā)射波長505 nm，激發(fā)波長488 nm)。測定基礎(chǔ)值(靜息時)后，依次加入AngⅡ(終濃度10-7mol/L)、CaCl2(原液為1 mol/L，加入D-Hank′s至過量)、TritonX-100(終濃度1%)、EGTA(終濃度10 μmol/L)。動態(tài)觀察細胞內(nèi)Ca2+釋放引起的鈣熒光強度(FI)的變化。采用LSM510軟件對數(shù)據(jù)、圖形進行實時動態(tài)測量與分析，根據(jù)給藥(AngⅡ)前后單個細胞的FI值計算出細胞內(nèi)[Ca2+]i，公式如下：[Ca2+]i(nmol/L)=kd×(F-Fmin)/(Fman-F)。kd 為Fluo-3/AM與Ca2+結(jié)合反應(yīng)的解離參數(shù)，室溫下kd=320 nmol/L；F為實際測得的FI值；Fmin為加入EGTA將細胞內(nèi)Ca2+全部螯合，使細胞內(nèi)無Ca2+時的FI值；Fmax為加入CaCl2、TritonX-100細胞內(nèi)Ca2+飽和時的FI值。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α對主動脈環(huán)收縮功能的影響 有鈣條件下，去內(nèi)皮TNF-α組給予AngⅡ后主動脈環(huán)的收縮幅度高于去內(nèi)皮對照組；無鈣條件下，去內(nèi)皮無鈣TNF-α組給予AngⅡ后主動脈環(huán)的收縮幅度亦高于去內(nèi)皮無鈣對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2 VSMC鑒定 VSMC細胞呈長梭形，胞質(zhì)多有突起，核呈圓形、卵圓形。細胞可出現(xiàn)重疊生長現(xiàn)象，光鏡下觀察呈峰谷樣生長；免疫熒光抗α-肌動蛋白抗體染色陽性，沿細胞長軸與肌絲相同呈絲狀排列，陽性細胞占總細胞數(shù)的95%以上，表明所獲細胞為VSMC，純度可達95%以上，電鏡下可見細胞內(nèi)束狀肌絲結(jié)構(gòu)(見圖1)。

表1 有鈣條件和無鈣條件下各組主動脈環(huán)對AngⅡ的反應(yīng)性

Table1 In Ca2+-present and Ca2+-free Kreb buffer，the reactiveness of aorta ring induced by AngⅡ in different groups

組別只數(shù)主動脈環(huán)對AngⅡ的反應(yīng)性平均值(x±s)有鈣條件下 去內(nèi)皮對照組6014015044021024028024±011 去內(nèi)皮TNF-α組6030025045069087060053±024?無鈣條件下 去內(nèi)皮無鈣對照組6015000015002004021010±008 去內(nèi)皮無鈣TNF-α組6021014023014015024019±005△

注：與去內(nèi)皮對照組比較，*t=-2.645，P=0.025；與去內(nèi)皮無鈣對照組比較，△t=-2.35，P=0.047

注：A為新生VSMC(×200)，B為傳代VSMC(×400)，C為α-肌動蛋白抗體熒光染色(×100)，D為光鏡下細胞內(nèi)的肌絲結(jié)構(gòu)(×10 000)

圖1 VSMC細胞鑒定結(jié)果

Figure1 Identification result of VSMC

2.3 VSMC內(nèi)[Ca2+]i測定 4組VSMC靜息狀態(tài)下[Ca2+]i無自主上升，在無鈣緩沖液中，靜息狀態(tài)下4組VSMC內(nèi)[Ca2+]i間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。加入AngⅡ后，4組[Ca2+]i升高值間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中TNF-α組VSMC內(nèi)[Ca2+]i均高于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而2-APB拮抗對照組、2-APB拮抗TNF-α組VSMC內(nèi)[Ca2+]i間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。測鈣圖見圖2。

3 討論

許多學(xué)者認為在感染性休克時由感染促發(fā)的全身炎性反應(yīng)為介導(dǎo)的二次打擊對器官的損害比原發(fā)感染作用更大，常造成血流動力學(xué)的紊亂和器官功能衰竭。TNF-α被公認為是引起感染性休克、MOF的主要遞質(zhì)。Hollenberg等[7]應(yīng)用主動脈環(huán)實驗證實大劑量TNF-α(1 000 U/ml)不僅作用于血管內(nèi)皮，也可直接作用于血管平滑肌，導(dǎo)致血管舒張，對收縮劑反應(yīng)性下降，但其所采用的TNF-α劑量明顯高于臨床報道范圍(200～800 mg/ml，相當(dāng)于10～40 U/ml)，而Murphey等[8]在注射脂多糖(LPS)前給豬注射小劑量TNF-α(500 ng/kg)，發(fā)現(xiàn)可以降低死亡率并減輕低血壓的程度，提示小劑量TNF-α具有保護作用。說明TNF-α作為一種多效性的細胞因子，其效應(yīng)有害或有利于機體主要取決于產(chǎn)生的數(shù)量、組織特異性定位、局部TNF-α結(jié)合蛋白的活性及細胞因子的環(huán)境等[9]。有報道指出，在失血性休克時，VSMC內(nèi)[Ca2+]i的調(diào)節(jié)能力紊亂可能是造成休克的原因[10]；一些治療休克的藥物作用靶點也是調(diào)節(jié)VSMC內(nèi)[Ca2+]i[11]。本實驗應(yīng)用的去內(nèi)皮主動脈環(huán)的反應(yīng)性變化代表了VSMC的舒縮狀態(tài)，VSMC的收縮受AngⅡ等多種血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)，后者與細胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合，激活磷脂酶C的β亞型，催化質(zhì)膜磷脂酰肌醇二磷酸水解，生成三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯。IP3與1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3Rs)結(jié)合促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲備Ca2+釋放引起細胞收縮。細胞內(nèi)[Ca2+]i變化能反映VSMC的功能狀態(tài)，因此監(jiān)測細胞內(nèi)[Ca2+]i變化能反映細胞的舒縮狀態(tài)。而Fluo-3/AM是常用的鈣熒光指示劑，其與細胞內(nèi)游離鈣呈高度特異性結(jié)合，其FI值與[Ca2+]i呈正比。細胞內(nèi)Ca2+來源于細胞外Ca2+內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫的鈣釋放[12]。而IP3Rs及RYR受體是主要的細胞內(nèi)儲備Ca2+釋放通道，在VSMC內(nèi)主要受IP3Rs調(diào)控，這一點可被2-APB阻斷Ca2+釋放實驗來證明。

注：A為對照組，B為TNF-α組，C為2-APB拮抗TNF-α組

圖2 各組VSMC在AngⅡ刺激下細胞內(nèi)FI的時間變化曲線

Figure2 AngⅡ-induced VSMC intracellular calcium fluorescence intensity(FI)-time curves in different groups

表2 AngⅡ刺激下4組VSMC內(nèi)[Ca2+]i比較

注：與TNF-α組比較，*P<0.001

本實驗結(jié)果顯示：(1)與對照組比較，在有鈣條件下加入5 g/L TNF-α能使去內(nèi)皮主動脈環(huán)對AngⅡ的反應(yīng)性升高；在無鈣條件下加入5 g/L TNF-α仍能使去內(nèi)皮主動脈環(huán)對AngⅡ的反應(yīng)性升高，提示主動脈環(huán)對AngⅡ的反應(yīng)性升高與細胞內(nèi)鈣釋放有關(guān)。(2)對照組、TNF-α組、2-APB拮抗對照組和2-APB拮抗TNF-α組VSMC靜息狀態(tài)下[Ca2+]i間無差異，而加入AngⅡ后，對照組和TNF-α組VSMC在短時間內(nèi)(約20 s)FI迅速增加(即峰值升高相)，TNF-α組[Ca2+]i升高值顯著高于對照組，說明TNF-α能促進VSMC內(nèi)儲備鈣釋放，與Song等[13]在實驗中發(fā)現(xiàn)感染性休克大鼠VSMC內(nèi)[Ca2+]i明顯增加的結(jié)果一致。由于胞外液無鈣，胞內(nèi)鈣儲庫排空后得不到再充盈，F(xiàn)I并未出現(xiàn)緩慢持久升高；當(dāng)向細胞外液加入過量的CaCl2時兩組細胞均出現(xiàn)鈣飽和狀態(tài)且Fmax一致，提示兩組細胞的Fluo-3/AM負載水平及活性無差異。在加入2-APB后，2-APB拮抗對照組和2-APB拮抗TNF-α組VSMC此效應(yīng)均可被40 μmol/L的2-APB完全阻斷，表現(xiàn)為對AngⅡ刺激無反應(yīng)，[Ca2+]i升高值無差異。故TNF-α 間接影響細胞內(nèi)[Ca2+]i是通過IP3Rs通路起作用的。

總之，TNF-α通過IP3Rs通路增強VSMC內(nèi)鈣釋放，能夠使主動脈環(huán)對縮血管物質(zhì)的反應(yīng)性增強，這條信號通路與TNF-α促進核因子-κB受體活化因子配體-RANKL誘導(dǎo)小鼠骨髓巨噬細胞破骨細胞形成與分化的信號通路以及TNF-α調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸內(nèi)鈣信號的通路是一致的[14-15]，這也許是感染性休克早期機體維持血壓穩(wěn)定的機制之一。進一步推測TNF-α在休克早期促進細胞內(nèi)儲備鈣大量釋放使細胞內(nèi)鈣耗竭，可能是導(dǎo)致休克晚期血管收縮性下降難以維持血壓的原因之一，進一步明確這一信號通路及其下游調(diào)控機制是未來的研究方向。

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