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        高脂飼養(yǎng)結(jié)合腹主動(dòng)脈球囊損傷制作兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化模型的研究*

        2014-02-08 07:59:24岳增輝胡崗珠
        中國中醫(yī)急癥 2014年5期
        關(guān)鍵詞:高脂造模球囊

        楊 俊 岳增輝 謝 濤 胡崗珠

        (湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410000)

        兔是食草動(dòng)物,對(duì)高脂飼料敏感,是較易建立動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物之一。此模型特點(diǎn)是復(fù)制簡(jiǎn)單、建模時(shí)間短、成活率高、損傷條件可控性好、易于評(píng)判,適用于預(yù)防治療等研究。本課題組曾采用高脂加免疫損傷的方法造模,但存在造模周期長(zhǎng)、兔死亡率較高的缺點(diǎn)[1-2]?,F(xiàn)在多采用高脂喂養(yǎng)結(jié)合球囊損傷術(shù)建立腹主動(dòng)脈粥樣硬化(AS)模型的方法,比之于以前的高脂結(jié)合免疫損傷的方法縮短了造模時(shí)間,且造模成功率更高、更穩(wěn)定,但還是存在動(dòng)物死亡率較高的問題[3]。為縮短造模時(shí)間及降低死亡率,本實(shí)驗(yàn)采用高脂喂養(yǎng)結(jié)合球囊損傷的方法,但調(diào)整了高脂飼料的配方,同時(shí)更加注重實(shí)驗(yàn)兔的飲食、衛(wèi)生及術(shù)后感染預(yù)防,以此縮短造模時(shí)間及控制死亡率,為研究AS提供最佳的實(shí)驗(yàn)?zāi)P汀,F(xiàn)報(bào)告如下。

        1 材料與方法

        1.1 試劑與儀器 TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙科威實(shí)業(yè)有限公司);全自動(dòng)生化分析儀Roche Hitachi917型(日本日立公司);瑞典產(chǎn)LKB-Ш型超薄切片機(jī);LEICADM LB2型雙目顯微鏡 (德國LEICA公司)等;球囊導(dǎo)管與附件(2.5~3.0 mm×20 mm普通球囊導(dǎo)管,美國Cordis公司;0.018/300 cm導(dǎo)引導(dǎo)絲,美國Cordis公司;球囊擴(kuò)張壓力泵,美國Cordis公司);膽固醇(sigma公司);蛋黃粉(安徽亳州市眾意蛋業(yè)有限責(zé)任公司);豬油(市售)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性新西蘭大耳白兔(普通級(jí))20只,體質(zhì)量1.5~2.0 kg,月齡2~3個(gè)月,由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供 [許可證號(hào):SCXK (湘)2009-0012]。20只兔全部采用高脂喂養(yǎng)加球囊損傷法造模,喂含2%膽固醇、15%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉和5%豬油的顆粒飼料,每次50 g,每日早晚2次。普通飼養(yǎng)1周、高脂喂養(yǎng)2周后實(shí)施腹主動(dòng)脈球囊損傷術(shù),術(shù)后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。所有動(dòng)物均單籠喂飼,飲水不限,自由攝食,每日每只進(jìn)食120 g飼料,術(shù)后喂養(yǎng)8周。每只分籠圈養(yǎng)于動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室。于第10周末處死前頸靜脈采血,取損傷段腹主動(dòng)脈固定、切片、HE染色。

        1.3 球囊損傷腹主動(dòng)脈內(nèi)膜的方法 實(shí)驗(yàn)兔術(shù)前12 h禁食,不禁水。手術(shù)器械術(shù)前消毒30 min,稱體質(zhì)量,3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)耳緣靜脈麻醉。出現(xiàn)呼吸深慢、四肢癱軟、角膜反射遲鈍標(biāo)志麻醉成功。球囊損傷方法:麻醉后經(jīng)耳緣靜脈注射肝素鈉200 U/kg,固定,將兔右側(cè)大腿內(nèi)側(cè)毛發(fā)剪去。常規(guī)消毒皮膚,鋪巾。在股動(dòng)脈搏動(dòng)明顯處沿右股動(dòng)脈走行方向縱行逐層切開皮膚,鈍性分離肌肉,暴露股動(dòng)靜脈并游離股動(dòng)脈約2~3 cm。將股動(dòng)脈近心端穿線提起,遠(yuǎn)心端結(jié)扎。用剪刀斜向?qū)⒐蓜?dòng)脈剪一小口,送入軟頭導(dǎo)絲,沿導(dǎo)絲導(dǎo)入球囊導(dǎo)管深度約20 cm。向球囊內(nèi)注入肝素,保持壓力為6~8標(biāo)準(zhǔn)大氣壓(atm),抗阻力牽拉球囊至髂動(dòng)脈,抽空球囊。重復(fù)上述過程2次后退出導(dǎo)管,結(jié)扎股動(dòng)脈,逐層縫合,碘伏擦拭創(chuàng)口。視出血量補(bǔ)充生理鹽水。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素40 U并用碘伏擦拭傷口預(yù)防感染。放回兔籠,自行蘇醒。

        1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 高脂喂養(yǎng)10周,經(jīng)兔耳緣靜脈麻醉后取頸靜脈血離心,取血清進(jìn)行血脂檢測(cè)。解剖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,根據(jù)球囊損傷術(shù)中球囊導(dǎo)管進(jìn)入的深度及損傷長(zhǎng)度,截取損傷段腹主動(dòng)脈約1.5~2.0 cm,用生理鹽水稍沖洗后以4%多聚甲醛保存,用于拍照和HE染色,光鏡觀察。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示,采用t檢驗(yàn)。 P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 一般情況 部分兔因用籠具喂養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)出現(xiàn)足癬,用10 g/L克霉唑液進(jìn)行局部噴灑并定期消毒籠具后消失。無實(shí)驗(yàn)兔出現(xiàn)腹瀉情況,2只兔麻醉意外死亡,3只死于術(shù)后感染。

        2.2 造模前后體質(zhì)量變化 兔實(shí)驗(yàn)的體質(zhì)量(2.10±0.12) kg,造模 10 周后為(2.90±0.35) kg,有明顯增加(P<0.05)。

        2.3 造模前后血脂水平變化 見表1。血脂檢測(cè)結(jié)果示,造模后TC、TG、LDL顯著升高,HDL顯著降低(P<0.05或 P< 0.01)。

        表1 造模前后兔的血脂情況(mmol/L

        表1 造模前后兔的血脂情況(mmol/L

        與造模前比較,△P<0.05,△△P<0.01。

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        2.4 病理形態(tài)學(xué)結(jié)果 (1)肉眼觀察。見圖1。造模前兔主動(dòng)脈形態(tài)正常,活體狀態(tài)下柔軟而有彈性,取材后見管腔內(nèi)膜光滑且管腔壁較薄,顏色粉紅均勻,未見脂質(zhì)沉積。造模后家兔主動(dòng)脈管腔壁增厚,可見突起于內(nèi)膜表面的散在、大片、大小不等的黃白色脂質(zhì)條紋及隆起的脂質(zhì)斑塊形成;解剖見肝臟明顯脂肪肝改變。(2)光鏡觀察。見圖2。造模前可見主動(dòng)脈內(nèi)膜完整,內(nèi)皮細(xì)胞單層緊貼內(nèi)彈力板,中層平滑肌細(xì)胞排列有序,內(nèi)膜無淋巴細(xì)胞、泡沫細(xì)胞聚集;彈力纖維無斷裂及溶解現(xiàn)象,無增生現(xiàn)象;胞漿呈嗜酸紅染,無明顯脂質(zhì)沉積。造模后可見主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞脫落,斑塊厚度與內(nèi)中膜厚度比值顯著增加,內(nèi)膜下可見大量泡沫細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集,呈圓形或長(zhǎng)形,可見“纖維帽”現(xiàn)象,斑塊中可見新生血管;中層平滑細(xì)胞排列紊亂,彈力纖維斷裂、溶解,斑塊向管腔凸出,膠原增生。

        圖1 肉眼觀察

        圖2 光鏡觀察

        3 討 論

        目前有研究表明,制作AS模型較為理想的動(dòng)物當(dāng)屬小型豬[4],但存在來源困難、飼料昂貴等缺點(diǎn),而家兔來源廣泛、飼料便宜,形成的斑塊與人類相似性也較高,是AS的易感動(dòng)物,因此常選兔作為AS的模型[5]。 內(nèi)皮損傷是 AS 形成的基礎(chǔ)[6],脂質(zhì)沉積是粥樣硬化病變的基本表現(xiàn)[7]。所以,在復(fù)制粥樣硬化動(dòng)物模型時(shí)應(yīng)在損傷內(nèi)皮的基礎(chǔ)上高脂喂養(yǎng)。故筆者采用腹主動(dòng)脈球囊損傷加高脂喂養(yǎng)的方法制作AS模型。此方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、死亡率低、損傷較小,且所制作的模型與人類接近,易于確定病變部位,方便取材。

        本模型制作與業(yè)者[3]造模比較,明顯縮短了造模時(shí)間(2周),且未出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)兔因腹瀉而死亡的情況,成功降低了死亡率。分析主要原因是:(1)加大了高脂飼料中膽固醇、蛋黃粉、豬油的比例;(2)動(dòng)物房環(huán)境潮濕,定期對(duì)動(dòng)物房及籠具進(jìn)行清洗、消毒,可避免因感染導(dǎo)致腹瀉而死亡;(3)術(shù)后在青霉素抗感染的同時(shí)每日擦拭碘伏,控制術(shù)后傷口感染。

        [1] 岳增輝,何新群,常小榮,等.隔藥餅灸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔血脂的調(diào)節(jié)作用[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2011,9(5):47-48.

        [2] 何新群,岳增輝,常小榮,等.動(dòng)脈粥樣硬化兔模型的建立及評(píng)價(jià)[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(9):27-29.

        [3] 吳同啟,顧寧.寧心痛顆粒干預(yù)模型兔動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊機(jī)制研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2011,26(5):1042-1046.

        [4] 劉錄山,楊永宗,馮大明,等.小型豬動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性模型研究[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2006,33(2):196-200.

        [5] Rafael A,Nalkov,Donald C,et al.Carbohydrate and lipid metabolismin farmanimals[J].The Journal of Nutrition,2007,137(3):702-705.

        [6] 周曉峰,王佐.內(nèi)皮祖細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中的作用[J].中國動(dòng)脈硬化雜志,2007,15(12):940-942.

        [7] 張運(yùn).動(dòng)脈粥樣硬化研究的當(dāng)前問題[J].中華心血管病雜志,2011,39(9):785-788.

        [8] 常小榮,嚴(yán)潔,岳增輝,等.隔藥餅灸對(duì)高脂血癥兔高低密度脂蛋白含量及比值的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2004,11(12):1054-1055.

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