楊 俊 岳增輝 謝 濤 胡崗珠

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410000）

兔是食草動物，對高脂飼料敏感，是較易建立動脈粥樣硬化的動物之一。此模型特點(diǎn)是復(fù)制簡單、建模時間短、成活率高、損傷條件可控性好、易于評判，適用于預(yù)防治療等研究。本課題組曾采用高脂加免疫損傷的方法造模，但存在造模周期長、兔死亡率較高的缺點(diǎn)［1-2］。現(xiàn)在多采用高脂喂養(yǎng)結(jié)合球囊損傷術(shù)建立腹主動脈粥樣硬化（AS）模型的方法，比之于以前的高脂結(jié)合免疫損傷的方法縮短了造模時間，且造模成功率更高、更穩(wěn)定，但還是存在動物死亡率較高的問題［3］。為縮短造模時間及降低死亡率，本實(shí)驗(yàn)采用高脂喂養(yǎng)結(jié)合球囊損傷的方法，但調(diào)整了高脂飼料的配方，同時更加注重實(shí)驗(yàn)兔的飲食、衛(wèi)生及術(shù)后感染預(yù)防，以此縮短造模時間及控制死亡率，為研究AS提供最佳的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器 TGL16M臺式高速冷凍離心機(jī)（長沙科威實(shí)業(yè)有限公司）；全自動生化分析儀Roche Hitachi917型（日本日立公司）；瑞典產(chǎn)LKB-Ш型超薄切片機(jī)；LEICADM LB2型雙目顯微鏡 （德國LEICA公司）等；球囊導(dǎo)管與附件（2.5~3.0 mm×20 mm普通球囊導(dǎo)管，美國Cordis公司；0.018/300 cm導(dǎo)引導(dǎo)絲，美國Cordis公司；球囊擴(kuò)張壓力泵，美國Cordis公司）；膽固醇（sigma公司）；蛋黃粉（安徽亳州市眾意蛋業(yè)有限責(zé)任公司）；豬油（市售）。

1．2 實(shí)驗(yàn)動物 雄性新西蘭大耳白兔（普通級）20只，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，月齡2～3個月，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供 ［許可證號：SCXK （湘）2009-0012］。20只兔全部采用高脂喂養(yǎng)加球囊損傷法造模，喂含2%膽固醇、15%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉和5%豬油的顆粒飼料，每次50 g，每日早晚2次。普通飼養(yǎng)1周、高脂喂養(yǎng)2周后實(shí)施腹主動脈球囊損傷術(shù)，術(shù)后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。所有動物均單籠喂飼，飲水不限，自由攝食，每日每只進(jìn)食120 g飼料，術(shù)后喂養(yǎng)8周。每只分籠圈養(yǎng)于動物中心實(shí)驗(yàn)室。于第10周末處死前頸靜脈采血，取損傷段腹主動脈固定、切片、HE染色。

1．3 球囊損傷腹主動脈內(nèi)膜的方法 實(shí)驗(yàn)兔術(shù)前12 h禁食，不禁水。手術(shù)器械術(shù)前消毒30 min，稱體質(zhì)量，3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）耳緣靜脈麻醉。出現(xiàn)呼吸深慢、四肢癱軟、角膜反射遲鈍標(biāo)志麻醉成功。球囊損傷方法：麻醉后經(jīng)耳緣靜脈注射肝素鈉200 U/kg，固定，將兔右側(cè)大腿內(nèi)側(cè)毛發(fā)剪去。常規(guī)消毒皮膚，鋪巾。在股動脈搏動明顯處沿右股動脈走行方向縱行逐層切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露股動靜脈并游離股動脈約2~3 cm。將股動脈近心端穿線提起，遠(yuǎn)心端結(jié)扎。用剪刀斜向?qū)⒐蓜用}剪一小口，送入軟頭導(dǎo)絲，沿導(dǎo)絲導(dǎo)入球囊導(dǎo)管深度約20 cm。向球囊內(nèi)注入肝素，保持壓力為6~8標(biāo)準(zhǔn)大氣壓（atm），抗阻力牽拉球囊至髂動脈，抽空球囊。重復(fù)上述過程2次后退出導(dǎo)管，結(jié)扎股動脈，逐層縫合，碘伏擦拭創(chuàng)口。視出血量補(bǔ)充生理鹽水。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素40 U并用碘伏擦拭傷口預(yù)防感染。放回兔籠，自行蘇醒。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 高脂喂養(yǎng)10周，經(jīng)兔耳緣靜脈麻醉后取頸靜脈血離心，取血清進(jìn)行血脂檢測。解剖實(shí)驗(yàn)動物，根據(jù)球囊損傷術(shù)中球囊導(dǎo)管進(jìn)入的深度及損傷長度，截取損傷段腹主動脈約1.5~2.0 cm，用生理鹽水稍沖洗后以4%多聚甲醛保存，用于拍照和HE染色，光鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 部分兔因用籠具喂養(yǎng)時間長出現(xiàn)足癬，用10 g/L克霉唑液進(jìn)行局部噴灑并定期消毒籠具后消失。無實(shí)驗(yàn)兔出現(xiàn)腹瀉情況，2只兔麻醉意外死亡，3只死于術(shù)后感染。

2.2 造模前后體質(zhì)量變化 兔實(shí)驗(yàn)的體質(zhì)量（2.10±0.12） kg，造模 10 周后為（2.90±0.35） kg，有明顯增加（P＜0.05）。

2.3 造模前后血脂水平變化 見表1。血脂檢測結(jié)果示，造模后TC、TG、LDL顯著升高，HDL顯著降低（P＜0.05或 P＜ 0.01）。

表1 造模前后兔的血脂情況（mmol/L

表1 造模前后兔的血脂情況（mmol/L

與造模前比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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2.4 病理形態(tài)學(xué)結(jié)果 （1）肉眼觀察。見圖1。造模前兔主動脈形態(tài)正常，活體狀態(tài)下柔軟而有彈性，取材后見管腔內(nèi)膜光滑且管腔壁較薄，顏色粉紅均勻，未見脂質(zhì)沉積。造模后家兔主動脈管腔壁增厚，可見突起于內(nèi)膜表面的散在、大片、大小不等的黃白色脂質(zhì)條紋及隆起的脂質(zhì)斑塊形成；解剖見肝臟明顯脂肪肝改變。（2）光鏡觀察。見圖2。造模前可見主動脈內(nèi)膜完整，內(nèi)皮細(xì)胞單層緊貼內(nèi)彈力板，中層平滑肌細(xì)胞排列有序，內(nèi)膜無淋巴細(xì)胞、泡沫細(xì)胞聚集；彈力纖維無斷裂及溶解現(xiàn)象，無增生現(xiàn)象；胞漿呈嗜酸紅染，無明顯脂質(zhì)沉積。造模后可見主動脈內(nèi)皮細(xì)胞脫落，斑塊厚度與內(nèi)中膜厚度比值顯著增加，內(nèi)膜下可見大量泡沫細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集，呈圓形或長形，可見“纖維帽”現(xiàn)象，斑塊中可見新生血管；中層平滑細(xì)胞排列紊亂，彈力纖維斷裂、溶解，斑塊向管腔凸出，膠原增生。

圖1 肉眼觀察

圖2 光鏡觀察

3 討 論

目前有研究表明，制作AS模型較為理想的動物當(dāng)屬小型豬［4］，但存在來源困難、飼料昂貴等缺點(diǎn)，而家兔來源廣泛、飼料便宜，形成的斑塊與人類相似性也較高，是AS的易感動物，因此常選兔作為AS的模型［5］。 內(nèi)皮損傷是 AS 形成的基礎(chǔ)［6］，脂質(zhì)沉積是粥樣硬化病變的基本表現(xiàn)［7］。所以，在復(fù)制粥樣硬化動物模型時應(yīng)在損傷內(nèi)皮的基礎(chǔ)上高脂喂養(yǎng)。故筆者采用腹主動脈球囊損傷加高脂喂養(yǎng)的方法制作AS模型。此方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、死亡率低、損傷較小，且所制作的模型與人類接近，易于確定病變部位，方便取材。

本模型制作與業(yè)者［3］造模比較，明顯縮短了造模時間（2周），且未出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)兔因腹瀉而死亡的情況，成功降低了死亡率。分析主要原因是：（1）加大了高脂飼料中膽固醇、蛋黃粉、豬油的比例；（2）動物房環(huán)境潮濕，定期對動物房及籠具進(jìn)行清洗、消毒，可避免因感染導(dǎo)致腹瀉而死亡；（3）術(shù)后在青霉素抗感染的同時每日擦拭碘伏，控制術(shù)后傷口感染。

［1］ 岳增輝，何新群，常小榮，等.隔藥餅灸對動脈粥樣硬化兔血脂的調(diào)節(jié)作用［J］.中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2011，9（5）：47-48.

［2］ 何新群，岳增輝，常小榮，等.動脈粥樣硬化兔模型的建立及評價［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（9）：27-29.

［3］ 吳同啟，顧寧.寧心痛顆粒干預(yù)模型兔動脈粥樣硬化易損斑塊機(jī)制研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（5）：1042-1046.

［4］ 劉錄山，楊永宗，馮大明，等.小型豬動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性模型研究［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2006，33（2）：196-200.

［5］ Rafael A，Nalkov，Donald C，et al．Carbohydrate and lipid metabolismin farmanimals［J］．The Journal of Nutrition，2007，137（3）：702-705．

［6］ 周曉峰，王佐.內(nèi)皮祖細(xì)胞在動脈粥樣硬化進(jìn)程中的作用［J］.中國動脈硬化雜志，2007，15（12）：940-942.

［7］ 張運(yùn).動脈粥樣硬化研究的當(dāng)前問題［J］.中華心血管病雜志，2011，39（9）：785-788.

［8］ 常小榮，嚴(yán)潔，岳增輝，等.隔藥餅灸對高脂血癥兔高低密度脂蛋白含量及比值的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11（12）：1054-1055.