羅忠勤，陳小文

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西南昌330006)

·實(shí)驗(yàn)研究·

江西南昌郊區(qū)松樹花粉過敏原的分離與鑒定

羅忠勤，陳小文

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西南昌330006)

目的對江西南昌郊區(qū)松樹花粉的變應(yīng)原組分進(jìn)行分離及免疫學(xué)鑒定。方法提取松樹花粉粗提液，然后通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對松樹花粉的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離并測定其分子量,采用免疫印跡(Western-blotting)法鑒定其變應(yīng)原成分。結(jié)果松樹花粉粗提液有10余條蛋白帶,其中分子量為12kD、26kD和100kD的蛋白可與松樹花粉過敏性病人血清IgE結(jié)合，其中26kD為主要變應(yīng)原。結(jié)論對松樹花粉變應(yīng)原進(jìn)行了初步的分離、鑒定，為進(jìn)一步對松樹花粉變態(tài)反應(yīng)性疾病的臨床診斷和治療提供初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

松樹花粉;變應(yīng)原;SDS-PAGE；Western-blotting

變態(tài)反應(yīng)性疾病是臨床上的常見病、多發(fā)病?；ǚ圩鳛橐环N重要的吸入性的過敏原,可引起“花粉癥”(枯草熱)等疾病的發(fā)生及相應(yīng)病癥,如眼結(jié)膜、鼻黏膜和支氣管過敏癥狀,甚至哮喘發(fā)作[1,2]。馬尾松在江西地區(qū)被廣泛地用作經(jīng)濟(jì)造林，同時具有種植面積廣泛，開花期長的特點(diǎn)，能產(chǎn)生大量花粉,且此類花粉帶有氣囊,可借風(fēng)力飄散至極遠(yuǎn)地區(qū)。國內(nèi)外不少氣傳致敏花粉調(diào)查均證實(shí)其為春季主要花粉之一[3-6]。松樹花粉大小約為60～120μm，不易進(jìn)入下呼吸道，并且蛋白含量低。因此長期以來被認(rèn)為具有低致敏性。近來，有不少文獻(xiàn)報(bào)道通過對花粉癥患者進(jìn)行皮內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)松科花粉亦是其主要過敏原之一[7,8]。但鮮見對其過敏原進(jìn)行分離和鑒定的報(bào)道。因此我們對南昌市郊主要經(jīng)濟(jì)林之一—馬尾松花粉粗提液進(jìn)行分離,并同時對其花粉變應(yīng)原免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料松樹花粉采自南昌市郊；14例對松樹花粉過敏患者血清標(biāo)本由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。

1.2 主要儀器和試劑垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜電泳槽、凝膠成像及分析系統(tǒng)。丙烯酰胺(Acr);十二烷基硫酸鈉(SDS)；生物素標(biāo)記的IgE二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素(鏈霉親和素)；其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 松樹花粉粗提液的提取取松樹花粉適量于液氮中充分研磨，按1∶3的比例用丙酮4℃浸泡，去脂直至上清澄清。揮發(fā)去丙酮，干燥后稱重，以1∶20比例加入Coca’s液(碳酸氫鈉2.75g，氯化鈉5g，結(jié)晶酚4g。加蒸餾水至1000ml，pH8.2)，攪拌提取72h，12000r/min，離心10min，上清用蒸餾水透析，以上操作均在4℃進(jìn)行。

1.4 松樹花粉粗提液進(jìn)行SDS-PAGE采用SDSPAGE體系對松樹花粉粗提液中蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離并比較其分子量。SDS-PAGE體系采用分離膠12%、濃縮膠5%,考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色，脫色后用凝膠成像及分析系統(tǒng)拍照。

1.5 松樹花粉變應(yīng)原的免疫學(xué)特性鑒定采用Western-blotting方法對松樹花粉變應(yīng)原進(jìn)行免疫活性分析，操作步驟如下：將凝膠中的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上；用TBS洗滌硝酸纖維膜3次；每次5min；將硝酸纖維膜用1%BSA封閉液封閉(4℃過夜)；用TBST洗硝酸纖維膜3次,每次5min；加對花粉過敏患者血清(用1%BSA-TBST進(jìn)行1;9稀釋)，37℃孵育2 h；同上洗膜3次；加入1∶1 000倍稀釋的生物素標(biāo)記的IgE二抗，室溫孵育2h；同上洗膜3次；加入1∶1000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，室溫孵育2h；同上洗膜5次，加入DAB(3,3＇-二氨基聯(lián)苯胺)顯色，凝膠成像及分析系統(tǒng)攝像后分析其相對分子質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 松樹花粉粗提液的SDS-PAGE松樹花粉粗提液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示松樹花粉粗提液主要有10余條深淺不一的蛋白區(qū)帶,其中12kD、26kD區(qū)帶蛋白含量豐富(圖1)。

圖1 松樹花粉粗提液SDS-PAGE

2.2 松樹花粉特異性變應(yīng)原鑒定花粉過敏患者血清對松樹花粉粗浸液中的變應(yīng)原進(jìn)行免疫印跡(圖2),結(jié)果顯示,松樹花粉提取液中可與過敏性病人血清IgE結(jié)合的蛋白質(zhì)分子量分別為12kD、26kD和100kD，其中分子量為26kD的為主要變應(yīng)原，可識別11/14份血清。分子量為12kD的變應(yīng)原，可識別4/14份血清。

3 討論

松屬花粉是我國多數(shù)地區(qū)重要的春季花粉致敏原[3-6]，然而松樹花粉由于其顆粒微粒較大，不易進(jìn)入下呼吸道，并且蛋白含量低。因此長期以來被認(rèn)為具有低致敏性。但近來多例報(bào)道證實(shí)了松樹花粉是我國部分城區(qū)的致敏原之一[7，8]。國外也有資料報(bào)道松屬花粉是多數(shù)地區(qū)重要的春季花粉致敏原。Gioulekas D[9]對希臘15年間的致敏花粉進(jìn)行記錄，發(fā)現(xiàn)松樹花粉數(shù)量占全年8.9%，1311例過敏性哮喘患者對松樹花粉致敏率為9.3%。Freeman GL[10]對過敏性患者進(jìn)行皮內(nèi)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對松樹花粉陽性致敏率為1.5%。Shida T[11]對日本最近十年花粉調(diào)查，發(fā)現(xiàn)最近十年盡管花粉數(shù)量計(jì)數(shù)不變，但是對松樹花粉皮內(nèi)試驗(yàn)陽性致敏率由2%上升到5%～6%。Park HJ[12]發(fā)現(xiàn)韓國最近20年對松樹花粉皮內(nèi)試驗(yàn)陽性致敏率由2.9%上升到14.3%。松樹花粉除了本身的抗原性外，還與其他多種物質(zhì)存在交叉反應(yīng)。據(jù)報(bào)道在對松子食物過敏的患者血清中發(fā)現(xiàn)存在對松樹花粉提取物特異性的IgE，并且對松子食物過敏的患者易形成松樹花粉熱。因此松子和松樹花粉兩者之間存在交叉反應(yīng)[13,14]。另外松樹花粉和抗碳水化合物決定簇(CCDs)之間存在交叉反應(yīng)[15]。Gastaminza G[16]等在松樹花粉提取物皮試陽性患者血清中，發(fā)現(xiàn)有85%的患者血清對42kD過敏原出現(xiàn)陽性反應(yīng)，40%患者對6～8kDa過敏原出現(xiàn)陽性反應(yīng)，不同的松樹種類之間松樹花粉的過敏原存在交叉反應(yīng)。并且許多患者僅僅單對松樹花粉致敏，因此對這些患者進(jìn)行特異性免疫治療是極有可能的[17]。

圖2 松樹花粉過敏患者血清的免疫印跡

本實(shí)驗(yàn)對南昌市郊區(qū)的被廣泛地用作經(jīng)濟(jì)造林的松科之一—馬尾松的花粉過敏原進(jìn)行分析。采用改進(jìn)的方法對松樹花粉蛋白進(jìn)行提取[18]，利用SDS-PAGE和Western-blotting的方法對松樹花粉提取液進(jìn)行分離和免疫學(xué)鑒定。發(fā)現(xiàn)在我區(qū)的松科花粉主要過敏原的分子量為26kD，也是粗提液中含量最豐富的蛋白之一。因此，有必要對該過敏原進(jìn)行純化，期望得到單一的變應(yīng)原制劑，實(shí)現(xiàn)對我區(qū)松科花粉過敏患者進(jìn)行更安全、更有效的診斷和脫敏治療。

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Isolation and immunological characterization analysis of allergen in pine pollen

L
UO Zhongqin,CHEN Xiaowen.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China.

Objective To isolate and characterize the allergenic components of pine pollen.Methods Pine pollen coarse extraction fluid was extracted,and the proteins of pine pollen extraction and their molecular were analyzed by SDS-PAGE.To characterize the allergenic components,pine pollen coarse extraction fluid was analyzed by western-blotting.Results The pine pollen coarse extraction fluid displayed more than ten protein bands by SDS-PAGE,and three bands(relative molecular weights were 12 kD,26 kD and 100 kD,respectively)could react with IgE in the sera of patients with allergy to pine pollen.Among the three bands,the 26 kD protein was the major allergen.Conclusion Our study of preliminary isolation and immunological characterization of the allergenic components in pine pollen will be used as a base for diagnosis and therapy of pine pollen related allergy.

Pine pollen;Allergen;SDS-PAGE；Western-blotting

R392.8，R446.62

A

1674-1129(2014)06-0688-02DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.013

2014-08-21；

2014-10-28)

江西省衛(wèi)生廳基金(編號：20121039)

羅忠勤，女，出生于1963年8月，學(xué)士學(xué)位，副主任技師。研究方向?yàn)槊庖邔W(xué)檢驗(yàn)。

陳小文，男，出生于1975年12月，碩士學(xué)位，副主任技師。研究方向?yàn)槊庖邔W(xué)檢驗(yàn)。