劉淑媛,欒樹清,聞芳,簡(jiǎn)正偉,萬臘根,張長(zhǎng)林

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006)

PML/RARα融合基因不典型FISH信號(hào)模式的APL的實(shí)驗(yàn)與臨床特征研究

劉淑媛,欒樹清,聞芳,簡(jiǎn)正偉,萬臘根,張長(zhǎng)林

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006)

目的探討伴有PML/RARα不典型FISH信號(hào)模式的急性早幼粒細(xì)胞白血病的臨床和實(shí)驗(yàn)室特征。方法采用PML/RARα的DCDF-FISH技術(shù)、染色體核型分析及FLT3-ITD突變檢測(cè)技術(shù)對(duì)初診的52例急性早幼粒細(xì)胞白血病患者骨髓標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，比較FISH信號(hào)模式與其他檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系。結(jié)果在檢測(cè)的52例標(biāo)本中，51例存在PML/RARα融合基因，陽性率高達(dá)98.1%；51例FISH陽性患者中38例為典型的1R1G2F信號(hào)，13例呈不典型信號(hào)模式，其中2例為1R1G1F，3例為1R1G3F，6例為2R2G1F，1例為1R2G1F，1例為2R1G1F。將不典型FISH信號(hào)模式組和典型FISH信號(hào)模式組進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)不典型組的高白患者比率較典型組高(P>0.05)；且不典型FISH信號(hào)模式組中復(fù)雜核型與FLT3-ITD突變的發(fā)生率明顯高于典型信號(hào)組(P<0.05)。結(jié)論具有不典型FISH信號(hào)模式的APL患者常伴有復(fù)雜核型，F(xiàn)LT3-ITD突變等預(yù)后不良的指標(biāo)，其具體作用方式仍有待進(jìn)一步探討。

急性早幼粒細(xì)胞白血病；不典型FISH信號(hào)模式；FLT3-ITD突變；復(fù)雜核型異常

急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia，APL)是一種以早幼粒細(xì)胞分化受阻為主要特征的急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia, AML)。研究表明，90%以上的APL患者的白血病細(xì)胞中均存在非隨機(jī)染色體易位t(15;17)(q22;q21)，該易位使得17號(hào)染色體上的維甲酸受體(retinoic acid receptor，RARα)基因與位于15號(hào)染色體上的PML(Promylocytic leukemia)基因發(fā)生融合，形成PML-RARα融合基因，并編碼相應(yīng)的融合蛋白[1]。PML-RARα融合蛋白以“顯性負(fù)調(diào)控”的方式抑制野生型PML和RARα的功能，導(dǎo)致骨髓粒細(xì)胞分化受阻，被認(rèn)為是APL發(fā)病的關(guān)鍵因素[1，2]。而全反式維甲酸(ATRA)等藥物可以靶向PML/RARα蛋白降解，并誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化，使得APL成為一個(gè)可以治愈的腫瘤[3]。因此，t(15;17)相關(guān)融合基因PML/RARα的檢測(cè)對(duì)APL的診斷、預(yù)后評(píng)估、個(gè)體化治療具有重要的價(jià)值。

目前，用于檢測(cè)PML/RARα融合基因的方法主要有染色體顯帶分析、逆轉(zhuǎn)錄-PCR方法和熒光原位雜交方法(FISH)等[4-6]。FISH特別是雙色雙融合熒光原位雜交技術(shù)(DCDF-FISH)，作為一種具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、不受細(xì)胞周期限制的分子生物學(xué)技術(shù)，已經(jīng)廣泛運(yùn)用于臨床。采用DCDF-FISH技術(shù)檢測(cè)PML/RARα融合基因時(shí)，典型的信號(hào)模式為一紅一綠兩融合(1R1G2F)。當(dāng)出現(xiàn)變異性和復(fù)雜性t(15;17)易位時(shí)，F(xiàn)ISH的信號(hào)模式可能發(fā)生改變。因此研究不同的DCDF-FISH信號(hào)模式對(duì)APL疾病的進(jìn)展、治療以及預(yù)后的影響，具有非常重要的意義。本研究采用DCDF-FISH技術(shù)對(duì)52例初診的APL進(jìn)行PML/RARα融合基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)13例具有不典型FISH信號(hào)模式，并通過細(xì)胞遺傳學(xué)、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等的聯(lián)合分析，并對(duì)其臨床及實(shí)驗(yàn)室特征進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 臨床病例初診的52例APL患者均來自2010年至2012年南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，所有患者均根據(jù)WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)綜合檢測(cè)確診為APL，其中男性患者29例，女性患者23例，中位年齡為35歲(9～61歲)。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析治療前抽取骨髓標(biāo)本2ml，有核細(xì)胞計(jì)數(shù)后按(1～2)×106/ml進(jìn)行直接法或短期培養(yǎng)法制備染色體，并采用G顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析，分析20個(gè)分裂相細(xì)胞。染色體核型按照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN2005)》的有關(guān)規(guī)定加以識(shí)別和描述。

1.2.2 FISH分析檢測(cè)PML/RARα融合基因的雙色雙融探針購(gòu)自美國(guó)Vysis公司，探針應(yīng)用SpectrumOrangeTM標(biāo)記PML基因、SpectrumGreenTM標(biāo)記RARα基因。FISH操作步驟包括：滴片、變性、雜交、洗滌、復(fù)染以及熒光顯微鏡觀察間期細(xì)胞和分裂期細(xì)胞雜交信號(hào)。

1.2.3 FLT3-ITD突變檢測(cè)抽取患者骨髓標(biāo)本2ml，采用上海飛捷生物公司試劑盒提取細(xì)胞DNA。針對(duì)FLT3基因設(shè)計(jì)引物，正義鏈：5’-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3’；反義鏈：5’-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3’。PCR反應(yīng)體系10μl，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min后，95℃變性20s，52℃退火20s，72℃延伸20s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min，反應(yīng)產(chǎn)物4℃保存。取PCR產(chǎn)物于3%瓊脂糖凝膠，1×TAE液中電泳20min，用紫外光透視儀分析圖像并照相。野生型擴(kuò)增產(chǎn)物為329bp處出現(xiàn)單一峰，ITD突變型擴(kuò)增產(chǎn)物為在大于329bp處出現(xiàn)的特異性條帶。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析由于存在標(biāo)本理論頻數(shù)＜5，采用Fisher精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 DCDF-FISH檢測(cè)PML/RARα融合基因常見信號(hào)模式采用DCDF-FISH檢測(cè)PML/RARα?xí)r，正常細(xì)胞信號(hào)模式為2紅2綠(2R2G)模式(圖1a)。在典型的t(15;17)易位的細(xì)胞中，可見1紅1綠2融合(1R1G2F)信號(hào)模式，其中1紅1綠分別是正常的PML和正常的RARα基因，2個(gè)融合信號(hào)分別PML/RARα和RARα/PML信號(hào)(圖1b)。除1R1G2F信號(hào)模式(典型信號(hào)模式)，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)診斷中還發(fā)現(xiàn)5種信號(hào)模式，分被為1R1G1F，1R1G3F，2R2G1F，1R2G1F，2R1G1F(圖1c-g)。

圖1 DCDF-FISH方法檢測(cè)PML/RARα融合基因的信號(hào)模式

已進(jìn)行FISH檢測(cè)的52例初診APL患者中，51例患者存在融合信號(hào)，陽性率為98.1%，其中的38例為1R1G2F信號(hào)模式；13例出現(xiàn)不典型信號(hào)模式，其中2例為1R1G1F，3例為1R1G3F并伴有1R1G2F，6例為2R2G1F，1例為1R2G1F，1例為2R1G1F(表1、圖2、圖3)。

2.2 FISH信號(hào)模式與染色體核型關(guān)系在52例APL患者中，46例進(jìn)行了常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析，其中存在t(15;17)易位的患者27例，15例患者為正常核型，4例患者無分裂象，陽性率為58.7%。在13例含不典型信號(hào)模式的標(biāo)本中，12例進(jìn)行了核型分析，結(jié)果顯示6例為復(fù)雜異常核型，占46.2%，其中4例為伴t(15;17)(q22;q21)易位的復(fù)雜核型異常；2例為單純的t(15;17)(q22;q21)；正常核型3例；未見分裂象1例。38例典型信號(hào)模式組中，34例進(jìn)行了核型分析，其中1例存在t(15;17)(q22;q21)，并伴1q-、7q+、+r等復(fù)雜結(jié)構(gòu)異常，占2.63%；另有18例為單純的t(15;17)(q22;q21)；正常核型12例；未見分裂象3例。不典型FISH信號(hào)模式組中復(fù)雜核型比例較典型信號(hào)組高，且兩者差異顯著(P=0.0006)。

表1 13例具有不典型FISH信號(hào)模式的APL患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

注：a為7號(hào)患者易位模式；b為5號(hào)患者易位模式圖2 2R2G1F和1R1G3F信號(hào)模式的染色體分析

注：a箭頭顯示異常的紅色信號(hào)和融合信號(hào)；b箭頭顯示異常的綠信號(hào)和融合信號(hào)圖3 2R1G1F和1R2G1F的FISH信號(hào)模式

2.3 初診WBC計(jì)數(shù)與不典型PML/RARα的FISH信號(hào)關(guān)系13例具有不典型FISH信號(hào)模式的APL患者初診外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)為16.52(0.7～60.19)×109/L，其中高白細(xì)胞(＞10×109/L)患者6例，所占比46.16%；而38例具有典型FISH信號(hào)模式的APL患者初診WBC為12.05(0.5～75.8)×109/L，其中高白細(xì)胞患者11例，占28.9%。具有不典型FISH信號(hào)模式的患者中高白細(xì)胞患者較典型FISH信號(hào)模式組多，但兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性(P＞0.05)。

2.4 FLT3-ITD基因突變與不典型PML/RARα的FISH信號(hào)關(guān)系52例APL患者中，有47例進(jìn)行了FLT3-ITD突變檢測(cè)，7例FLT3-ITD突變陽性，陽性率為14.9%。13例不典型FISH信號(hào)模式的APL患者中有6例進(jìn)行了FLT3-ITD突變檢測(cè)，4例陽性，陽性率為66.7%；而進(jìn)行突變檢測(cè)的38例典型信號(hào)模式組3例發(fā)現(xiàn)FLT3-ITD突變，突變率為7.89%，明顯低于前者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.0026)。

3 討論

APL是AML中一個(gè)比較特殊的亞型，約占所有AML的10%，并且具有特異的形態(tài)學(xué)特征及細(xì)胞分子遺傳學(xué)特征；此病起源于髓系早幼粒細(xì)胞，由于其腫瘤細(xì)胞中存在較多的促凝顆粒，臨床上多伴發(fā)彌散性微血管凝血，易導(dǎo)致APL患者的早期死亡。目前，對(duì)于APL患者的初始治療多采用聯(lián)合維甲酸/亞砷酸及蒽環(huán)類藥物進(jìn)行誘導(dǎo)分化治療，以降低患者死亡率，延長(zhǎng)患者生存壽命[3]。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的APL患者具有特征性的t(15;17)(q22;q21)染色體易位形成的PML-RARα融合基因[1]。本研究中，通過對(duì)52例APL患者進(jìn)行檢測(cè)，DCDF-FISH法檢測(cè)PML-RARα融合基因的陽性率高達(dá)98.1%，而常規(guī)遺傳學(xué)核型分析t(15;17) (q22;q21)陽性率僅為54.3%，表明DCDF-FISH檢測(cè)PML-RARα融合基因敏感度高，對(duì)診斷APL具有決定性意義。

采用DCDF-FISH技術(shù)檢測(cè)PML/RARα?xí)r，典型的易位t(15；17)易位形成的兩條衍生的染色體der(15)和der(17)都有融合信號(hào)(圖1b)，但是由于在易位過程中會(huì)發(fā)生部分缺失、擴(kuò)展或涉及到3條以上的染色體，F(xiàn)ISH信號(hào)模式就會(huì)發(fā)生改變。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)13例患者的FISH結(jié)果呈不典型信號(hào)模式，占總體的25.5%。其中以2R2G1F(6例)和1R1G3F(3例)信號(hào)模式為主，通過染色體分析發(fā)現(xiàn)，2R2G1F信號(hào)模式為三條染色體循環(huán)易位(圖2a模式)，如7號(hào)患者易位方式為6p21-qter易位到17q22；17(17q21-q22)易位到15q22；15q22-qter易位到6p21(圖2a)。1R1G3F由ider(17)(q10)t (15;17)產(chǎn)生，如5號(hào)患者中兩個(gè)融合信號(hào)時(shí)由于衍生的17號(hào)染色體發(fā)生長(zhǎng)臂等臂導(dǎo)致(圖2b)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)兩例隱形易位的患者，這兩位患者染色體核型為正常核型，DCDF-FISH可以看見一個(gè)非常細(xì)小的熒光信號(hào)(圖3a-b示)，很容易作為非特異性信號(hào)，容易造成假陰性結(jié)果。最近，Campbell LJ等總結(jié)了10例這樣的病例，發(fā)現(xiàn)采用Vysis公司SF探針(single fusion probe)和分離探針(break apart probe)都不能檢測(cè)到融合信號(hào)，采用Vysis公司的DF探針(dual fusion probe)檢測(cè)到3例陽性患者(3/10)，而采用Cytocell公司的DF探針以及ES探針檢測(cè)陽性率為100%[7]。通過進(jìn)一步分析Campbell LJ等發(fā)現(xiàn)該信號(hào)模式為小片段的PML或RARα插入導(dǎo)致，由于Vysis公司探針過長(zhǎng)，不易與小片段雜交，從而導(dǎo)致陰性的出現(xiàn)，而Cytocell公司探針相對(duì)比Vysis公司小的多，容易與小片段雜交，因此可以檢測(cè)到小片段的異常。因此，在選擇FISH探針時(shí)要選擇大小適中的探針，探針太小容易出現(xiàn)非特異信號(hào)，容易造成假陽性，而探針太大有可能會(huì)出現(xiàn)假陰性。

大量研究結(jié)果表明具有單純的t(15;17)(q22; q21)的APL患者對(duì)ATRA敏感，CR(complete remission)率高(可達(dá)90%)，無病生存率高，五年生存率可達(dá)到80%，預(yù)后好。但是，除t(15;17)(q22;q21)外，還伴有一些其他染色體異常(additional chromosome abnormalities，ACAs)或者FLT3-ITD突變的患者[8-11]，對(duì)ATRA反應(yīng)性差，無病生存率和五年生存率明顯低于低于單純性t(15;17)(q22;q21)的患者。本研究中發(fā)現(xiàn)通過核型分析我們發(fā)現(xiàn)在38例具有典型FISH信號(hào)模式的APL患者中有1例伴有復(fù)雜核型；而13例具有不典型FISH信號(hào)模式的APL患者中有6例具有復(fù)雜核型；兩者差異有顯著性(P<0.05)。另外，在我們的研究中還發(fā)現(xiàn)含有不典型FISH信號(hào)模式的患者FLT3-ITD突變明顯高于典型信號(hào)模式的患者，表明具有不典型FISH信號(hào)模式的患者存在更為復(fù)雜的遺傳學(xué)異常，提示不典型信號(hào)模式的患者相對(duì)典型信號(hào)患者預(yù)后要差。

APL初始白細(xì)胞數(shù)也是評(píng)價(jià)APL患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)APL初始白細(xì)胞數(shù)大于10×109/L時(shí)，患者無病生成率和總生存率都明顯低于初始白細(xì)胞數(shù)低于10×109/L的患者[12]。在本研究的52例患者中，具有不典型信號(hào)模式的患者中白細(xì)胞數(shù)大于10×109/L的患者(46.16%)比典型信號(hào)模式的患者(28.9%)多(P=0.256)，雖然兩者無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但也能提示不典型信號(hào)模式的患者預(yù)后更差可能。

以上結(jié)果表明，具有不典型FISH信號(hào)模式的APL患者常伴有ACAs，F(xiàn)LT3-ITD以及高白細(xì)胞血癥等預(yù)后差的指標(biāo)。

[1]Biondi A,Rambaldi A,Alcalay M,et al.RAR-alpha gene rearrangements as a genetic marker for diagnosis and monitoring in acute promyelocytic leukemia[J].Blood,1991,77(7):1418-1422.

[2]Melnick A,Licht JD.Deconstructing a disease:RARalpha,its fusion partners,and their roles in the pathogenesis of acute promyelocytic leukemia[J].Blood,1999,93(10):3167-215.

[3]Wang ZY,Chen Z.Acute promyelocytic leukemia:from highly fatal to highly curable[J].Blood,2008,111(5):2505-2515.

[4]王蓉,繆扣榮,仇海榮,等.間期熒光原位雜交和常規(guī)染色體分析診斷急性早幼粒細(xì)胞白血病的比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2011,19(4):983-986.

[5]Lewis C,Patel V,Abhyankar S,et al.Microgranular variant of acutepromyelocyticleukemiawithnormalconventional cytogenetics,negative PML/RARA FISH and positive PML/RARA transcripts by RT-PCR[J].Cancer Genet,2011,204(9):522-523.

[6]江梅,萬臘根.RQ-PCR技術(shù)檢測(cè)白血病融合基因及其臨床應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2010,28(5):469-472.

[7]Campbell LJ,Oei P,Brookwell R,Shortt J,et al.FISH detection of PML-RARA fusion in ins(15;17)acute promyelocytic leukaemia depends on probe size[J].Biomed Res Int,2013,2013:164501.

[8]KaleemZ,WatsonMS,ZutterMM,etal.Acutepromyelocytic leukemia with additional chromosomal abnormalities and absence of Auer rods[J].Am J Clin Pathol,1999,112(1):113-118.

[9]馬力,李建勇,潘金蘭,等.伴有復(fù)雜核型的急性早幼粒細(xì)胞白血病的臨床及實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2010,18(3)：0552-0554.

[10]Thiede C,Steudel C,Mohr B,et al.Analysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia:association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosis[J].Blood,2002,99(12):4326-4335.

[11]Gallagher RE,Moser BK,Racevskis J,et al.Treatment-influenced associations of PML-RARα mutations,FLT3 mutations,and additional chromosome abnormalities in relapsed acute promyelocytic leukemia[J].Blood,2012,120(10):2098-108.

[12]Fenaux P,Chastang C,Chevret S,et a1.A randomized comparison of all transretinoic acid(ATRA)followed by chemotherapy and ATRA plus chemotherapy and the role of maintenance therapy in newly diagnosed acute promyelocytic leukemia[J].Blood,1999,94(4): 1192-1200.

The clinical and laboratory research of thirteen acute promyelocytic leukemia patients with atypical signal modes in FISH detection of PML/RARα fusion

LIU Shuyuan,LUAN Shuqing,WEN Fang,et al.

The Clinical Laboratory of the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China

Objective To explore the clinical and laboratory characteristics of acute promyelocytic leukemia with atypical signal modes in FISH detection of PML/RARα fusion.Methods Bone marrow samples from 52 patients with newly diagnosed acute promyelocytic leukemia were detected with DCDF-FISH for PML/RARα,karyotype analysis and PCR for gene mutation of FLT3-ITD.The relations between signal modes of DCDF-FISH and other test results were analyzed.Results PML/RARα fusion was identified in 51(98.1%)among 52 patients.We found that 38 cases had a typical signal mode(1R1G2F)and 13 cases had atypical signal modes including 2 1R1G1F,3 1R1G3F,6 2R2G1F,1 1R2G1F,1 2R1G1F.Comparing the clinical and laboratory characteristics of these two groups,we found that a high WBC was more prevalent in patients with atypical FISH signal modes(P> 0.05),and the atypical FISH signal modes were associated with higher percentage of complex chromosome abnormalities and FLT3-ITD(P<0.05).Conclusion APL patients with atypical FISH signal modes are often accompanied by some poor prognostic indicators such as complex chromosome abnormality and FLT3-ITD mutation，but the mechanism needs to be further discussed.

APL;Atypical FISH signal mode;FLT3-ITD mutation;Complex chromosome abnormality

R733.7

A

1674-1129(2014)04-0374-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.04.004

2014-03-17；

2014-07-03)

江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：20122BAB205025)作者簡(jiǎn)介：劉淑媛，女，出生于1989年4月，南昌大學(xué)2012級(jí)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)碩士研究生，研究方向：白血病的分子診斷。通信作者：張長(zhǎng)林，男，出生于1984年8月，畢業(yè)于上海交通大學(xué)，碩士學(xué)位，中級(jí)職稱，研究方向：白血病的分子診斷。