陳寧清，鄭司雨

1 浙江省醫(yī)療器械研究所，杭州市，310009

2 華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海市，200237

雙縮脲試劑在檢測蛋白質(zhì)上的應(yīng)用研究

【作者】陳寧清1，鄭司雨2

1 浙江省醫(yī)療器械研究所，杭州市，310009

2 華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海市，200237

目的 探討雙縮脲試劑在檢測蛋白質(zhì)應(yīng)用中，不同檢測條件對測試結(jié)果的影響。方法 采用雙縮脲法，選取三種不同儀器、試劑、校準物進行排列組合，組成27套檢測系統(tǒng)，每個檢測組合系統(tǒng)對5分樣本血清進行檢測，得到5個測定值，以全部血清總蛋白的測定值剔除離群值后得出的均值，以此計算出各個檢測組合系統(tǒng)運用雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)的偏倚。結(jié)果不同檢測儀器運用雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.467)，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.688，P=0.421)；不同檢測試劑運用雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.574)，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.784，P=0.011)；不同校準物運用雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.467)，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.289，P=0.000)。結(jié)論雙縮脲試劑在檢測蛋白質(zhì)應(yīng)用中，檢測試劑和校準物會對測試結(jié)果產(chǎn)生影響，在進行試驗比對的時候，有必要對檢測試劑和校準物造成的檢測偏差進行考慮。

雙縮脲；總蛋白；影響因素

0 引言

血清中含量最多的就是血清總蛋白(TP)，血清總蛋白包括白蛋白以及球蛋白兩大類。它具有維持血管內(nèi)正常膠體滲透壓和酸堿度、運輸多種代謝物、調(diào)節(jié)被運輸物質(zhì)的生理作用等多種功能，同時它還可以反映我們機體的免疫狀況。在臨床中對于血清總蛋白檢測可以了解我們身體的營養(yǎng)狀況、肝臟合成功能、腸道情況、腎臟病變等等，根據(jù)血清總蛋白檢測結(jié)果醫(yī)生結(jié)合其他臨床資料就可以對某些疾病做出診斷。

血清總蛋白測定目前常抽取靜脈血采用雙縮脲比色法測定，它是目前首先推薦的蛋白質(zhì)定量方法。此法的原理是蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下與二價銅離子(Cu2+)作用生成藍紫色的化合物，這種顏色反應(yīng)強度在一定濃度范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)含量成正比，經(jīng)與同樣處理的蛋白標準液比較，即可求得蛋白質(zhì)含量。此反應(yīng)的優(yōu)點是清、球蛋的反應(yīng)性相近，操作簡單，重復(fù)性好，干擾物質(zhì)少，為首選的常規(guī)方法。但是其也存在靈敏度較差，精度不高的問題。由于目前各醫(yī)院采用的檢測設(shè)備、試劑以及校準物是不一樣的。特別是不同生產(chǎn)廠家出品的雙縮脲試劑盒其組分不同，因此其吸光度也不一樣[1]。浙江省體外診斷試劑公共服務(wù)平臺在產(chǎn)品檢測過程中，有必要對這些因素對檢測結(jié)果的影響做出評價，從而就我們的檢測條件進行改進，制定出統(tǒng)一的指導(dǎo)標準，這有利于我們對雙縮脲試劑在檢測蛋白質(zhì)的檢測結(jié)果進行對比分析，便于醫(yī)生對疾病作出正確的診斷。

1 資料與方法

1.1 材料

(1) 樣本血清的來源 每日常規(guī)工作后收集新鮮血清27份，制備成5份不同濃度的混合血清，分裝于帶蓋的清潔試管內(nèi)，共135份。

(2) 檢測儀器 本次實驗采用三種檢測儀器，參考目前臨床應(yīng)用情況，選取應(yīng)用較為廣泛的三種檢測儀器，本次檢測儀器選取HI-TACHI-7060全自動生化分析儀、OLYMPUS AU400全自動生化分析儀、ADVIA1800全自動生化分析。

(3) 檢測試劑 本次實驗選取三種檢測試劑，參考目前臨床應(yīng)用情況，選取應(yīng)用較為廣泛的三種檢測試劑，本次檢測試劑選取中生北控、四川邁克、羅氏三個品牌。

(4) 校準物 本次實驗選取三種校準物，參考目前臨床應(yīng)用情況，選取應(yīng)用較為廣泛的三種校準物，本次檢測校準物選取邁瑞、重慶百克、科華生物三個品牌。

1.2 方法

檢測方法采用雙縮脲法，三種不同儀器、試劑、校準物進行排列組合，組成27套檢測系統(tǒng)，每個檢測組合系統(tǒng)對5分樣本血清進行檢測，得到5個測定值，一共135份檢測結(jié)果。選擇處理后正態(tài)性較好的一份血清作為研究對象，測定值與靶值(全部AST的測定值剔除離群值后得出的均值)之差除以靶值，即為偏倚，分別計算出各個檢測組合系統(tǒng)運用雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)的偏倚，先用SPSS18.0軟件按檢測儀器、檢測試劑和檢測校準物所得到的偏倚進行方差分析，檢驗差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義），從而確定影響雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)結(jié)果的因素。

2 結(jié)果

2.1 檢測儀器對檢測結(jié)果的影響

對HI-TACHI-7060全自動生化分析儀、OLYMPUS AU400全自動生化分析儀、ADVIA1800全自動生化分析三組不同檢測儀器的135份檢測結(jié)果進行分析：不同檢測儀器運用雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.467)，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.688，P=0.421)，詳見表1。

表1 不同檢測儀器對檢測結(jié)果的影響Tab.1 Effects of different detection instruments on testing results

2.2 檢測試劑對檢測結(jié)果的影響

對中生北控、四川邁克、羅氏三個品牌三種不同品牌的135份檢測結(jié)果進行分析：不同檢測試劑運用雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.574)，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.784，P=0.011)，詳見表2。

表2 不同檢測試劑對檢測結(jié)果的影響Tab.2 Effects of different detection reagents on testing results

2.3 校準物對檢測結(jié)果的影響

對邁瑞、重慶百克、科華生物三種不同校準物品牌的135份檢測結(jié)果進行分析：不同校準物運用雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.467)，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.289，P=0.000)，詳見表3。

表3 不同校準物對檢測結(jié)果的影響Tab.3 Effects of different methods of calibration on testing results

3 討論和結(jié)論

目前，血清中蛋白質(zhì)的檢測在臨床中已得到廣泛運用，血清中蛋白質(zhì)增高常見于脫水、血液濃縮和多發(fā)性骨髓瘤。血清中蛋白質(zhì)減低常見于血漿水分增加、肝功能障礙、消耗性疾病、營養(yǎng)不良、廣泛燒傷、腎病綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、大量反復(fù)放胸腔積液和腹水等。因此，血清中蛋白質(zhì)的檢測是醫(yī)生對疾病診斷、治療觀察、判斷預(yù)后的重要手段，血清總蛋白測定結(jié)果對疾病的診斷雖然不具有一定的特異性，但在臨床中可以結(jié)合其他資料來對疾病情況進行診斷，因此血清中蛋白質(zhì)的檢測值的準確性和一致性十分重要[2]。目前，雙縮脲法是全國臨床檢驗血清總蛋白的常規(guī)方法，因此，拋開檢測方法影響血清總蛋白檢測結(jié)果的實驗環(huán)境就包括檢測儀器、試劑以及校準物等[3-4]。從實際情況也可以看出，雙縮脲法在各家醫(yī)院應(yīng)用的統(tǒng)一性比較強，因此本研究重點分析雙縮脲法在檢測蛋白質(zhì)應(yīng)用中影響其檢測結(jié)果的檢測器材、試劑以及校準物。目前，全國各地經(jīng)濟發(fā)展水平不一樣，存在城鄉(xiāng)差距，各醫(yī)院的條件存在差距，因此使用的儀器、試劑、校準物也一樣。從使用的儀器來看，大多數(shù)醫(yī)院采用的分析儀都是奧林巴斯AU系列、日立HI-TACHI系列，這些分析儀等都經(jīng)過一定的性能評定，有的經(jīng)ISO/15189認定，系統(tǒng)誤差會很小，偏倚值也不大，而本次研究也證明了這一點[5]。目前檢測系統(tǒng)中試劑及試劑盒占有比較重要的地位，對結(jié)果影響較大，如比較好的試劑羅氏原裝試劑，在實驗室分析統(tǒng)計中常作為參照標準以評價其它試劑的質(zhì)量，但受當前醫(yī)療水平的限制，大小醫(yī)院使用的試劑參差不齊，沒有統(tǒng)一的標準。目前，各實驗室不斷引進新的儀器和檢驗方法，擁有多臺生化儀器，不同的試劑、校準物及試劑盒，為了有效監(jiān)測重大傳染病的發(fā)生，保證不同實驗室、不同檢測系統(tǒng)結(jié)果的一致性和可比性，是各中、大型醫(yī)院檢驗科追求的目標[6]。

本研究從另一角度通過探討影響檢測結(jié)果的主要因素，為臨床統(tǒng)一檢測條件及準確檢測血清總蛋白提供實驗依據(jù)。本次研究結(jié)果表明：不同檢測儀器運用雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.467)，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.688，P=0.421)；不同檢測試劑運用雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.574)，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.784，P=0.011)；不同校準物運用雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.467)，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.289，P=0.000)。不同試劑、儀器和校準物運用雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)的偏倚倚分析表明：(1)蛋白質(zhì)檢測已廣泛應(yīng)用于肝疾病及流行病學(xué)的研究，目前實驗室的檢測方法還是比較統(tǒng)一一直的，均采用雙縮脲法。(2)儀器方面，絕大多數(shù)醫(yī)院采用的分析儀如奧林巴斯AU系列、日立HITACHI系列等都經(jīng)過一定的性能評定，偏倚也應(yīng)當不大[7]。本次研究結(jié)果也表明：不同檢測儀器運用雙縮脲試劑檢測蛋白質(zhì)的偏倚其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。(3)雙縮脲試劑在檢測蛋白質(zhì)應(yīng)用中，試劑以及校準物對測試結(jié)果的影響較大，在檢測中具有重要的地位，由于各地醫(yī)院發(fā)展情況不一，實驗環(huán)境不同，在臨床中還沒有形成統(tǒng)一標準，雙縮脲試劑在檢測蛋白質(zhì)應(yīng)用中，不同試劑檢測、不同校準物對同一樣本的檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義，因此，可以判斷影響雙縮脲法檢測蛋白質(zhì)檢測結(jié)果的主要因素為試劑以及校準物。

我國臨床實驗室對于檢測結(jié)果的準確性都是非常的重視的，一般實驗室還要參加全國或全省的室間質(zhì)評活動，同時還每天對室內(nèi)質(zhì)量會進行控制，但由于檢測條件的不同，運用雙縮脲法檢測蛋白質(zhì)還是會存在一定的偏差，因此，有必要進行對比試驗，才能從根本上解決檢測結(jié)果準確性和一致性的問題，而對于那些正準備參加實驗室認可的醫(yī)學(xué)實驗室來說，這項工作就尤為重要了。完整的比對實驗它包含比對以及修正，通過對比試驗可以采取多種方法對檢測流程或結(jié)果進行校正：比如可以通過不同儀器測定同一份新鮮血清，對比檢測結(jié)果來對檢測儀器進行校正；也可以通過回歸分析的方式，選取影響因子，利用回歸方程求解找出影響因子來對其他檢測條件進行校正[8]。還可以用混合血清作為共同校準品校準各系統(tǒng)。不同實驗室應(yīng)根據(jù)自身情況，反復(fù)驗證來決定使用何種方法來校正。目前國內(nèi)相關(guān)研究多參考美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)的EP9-A[9]文件，對不同檢測系統(tǒng)的測定結(jié)果進行方法比和偏倚評估，為實現(xiàn)測定結(jié)果的溯源性和可比性提供實驗依據(jù)。因此，雙縮脲試劑在檢測蛋白質(zhì)應(yīng)用中，檢測試劑和校準物會對測試結(jié)果產(chǎn)生影響，在進行試驗比對的時候，有必要對檢測試劑和校準物造成的檢測偏差進行考慮。

[1] 王時南, 楊歡. 兩種校準品和3種雙縮脲試劑測定血清總蛋白結(jié)果偏倚評估及方法學(xué)評價[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2011(10): 125-128.

[2] 李晶. 血清總蛋白測定方法及臨床意義[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)藥應(yīng)用, 2012(9): 28-29.

[3] 張玲, 張玉春. 雙縮脲法測定血漿總蛋白含量的不確定度評定[J]. 甘肅醫(yī)藥, 2013(2): 126-128.

[4] National Committee for Clinical Laboratory Standards. Method comparison and bias estimation using patient samples; approved guideline,EP9-A[S]. NCCLS, Pennsylvania, 1995.

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[6] 閻政禮, 姜曉東, 童金英, 等. 不同檢測條件下血清總蛋白測定結(jié)果的偏倚分析[J]. 實用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2010(1): 27-29.

[7] 盧海景, 張紅鳳, 饒華春. 右旋糖酐對雙縮脲法測定血清總蛋白的干擾[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2013(20): 2729-2730.

[8] 陳惠. 1163 名健康人血液總蛋白水平的臨床分析[J]. 求醫(yī)問藥, 2012(4): 51-52.

[9] The National Committee for Clinic. Laboratory Standards. Method comparison and bias estimation using patient samples: approved guideline[M].Second Edition, EP9-A, 2002.

Application Research of Protein Test by Using Biuret Reagent

【W(wǎng)riters】Chen Ningqing1, Zheng Siyu2

1 Zhejiang Medical Device Institute, Hangzhou, 310009

2 School of Materials Science and Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai, 200237

Objective To investigate the biuret reagent to detect proteins in the application, the impact of different test conditions for test results. Methods The biuret method to select three different instruments, reagents, calibrators are arranged in combination to form 27 sets of detection systems, each detection system is a combination of 5 serum samples for testing, 5 measured values obtained, the selection process normality good a serum for the study to determine the mean value of all AST after culling outliers obtained in order to calculate the various detection systems use a combination of biuret reagent to detect proteins bias. Results The use of different detection equipment to detect proteins biuret reagent bias, homogeneity of variance (P=0.467), the difference was not statistically signifcant (F=1.688, P=0.421). different detection reagents using biuret reagent to detect proteins bias, homogeneity of variance (P=0.574), a statistically signifcant difference (F=5.784, P=0.011). different calibrators use biuret reagent to detect proteins bias, homogeneity of variance (P=0.467), the difference was statistically signifcant (F=5.289, P=0.000). Conclusion Biuret reagent in the detection of protein applications, impact detection reagents and calibrators will test result, during the test than when it is necessary to detect deviation detection reagents and calibrators due to be considered.

biuret, total protein, infuential factors

R446.1

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2014.06.020

1671-7104(2014)06-0458-03

2014-09-28

浙江省體外診斷試劑公共服務(wù)平臺（2011F30008）

陳寧清，E-mail: cnqcool@126.com