李明存，劉遠光，張 滌，王冬蘭

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江 佳木斯 154003)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見和嚴重的微血管并發(fā)癥之一。隨著糖尿病患病率的逐年增高以及患病人群年齡有開始向低的趨勢，DR已成為致盲的主要原因之一，這在很大程度上對患者、家庭和社會均造成極大的危害和負擔。目前已有多種藥物和制劑被用于防治DR的發(fā)生和進展，但由于DR的發(fā)病機制尚未有確切結(jié)論，盡管某些藥物臨床前實驗和臨床研究已取得了令人鼓舞的結(jié)果，但尚無一種藥物能有效控制DR的發(fā)展，因此尋找并篩選防治DR的藥物受到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的高度重視。有實驗研究表明大黃素對血管平滑肌細胞的增殖有抑制作用[1]，且對高糖條件下的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的增殖的抑制與有很多相似性[2]，因此從這一點出發(fā)，我們推測大黃素可能對DR的增殖趨勢也具有抑制作用。本研究通過復(fù)制糖尿病大鼠模型，給予大黃素后，觀察大鼠視網(wǎng)膜中FN和CD105表達情況的變化，研究大黃素對糖尿病視網(wǎng)膜病變的影響，以期為臨床治療提供佐證和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組

健康Wistar大鼠78只，體重180～200g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物一般情況良好，皮毛光澤，進食與活動正常，自然光線條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，隨機分為3組：正常對照組、DR組、DR+大黃素組。

1.1.2 試劑與儀器

大黃素購自西安飛達生物技術(shù)有限公司；STZ(Sigma 公司)由上海寶曼生物技術(shù)有限公司提供；兔抗大鼠FN、CD105單克隆抗體由武漢博士得生物工程有限公司提供；ONETOUCHSelectSimple穩(wěn)擇易血糖儀及其配套試紙由美國強生(中國)醫(yī)療器材有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立與處理

正常組大鼠始終給予常規(guī)飼養(yǎng)條件，不做特殊處理。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后將DR組和DR+大黃素組大鼠給予高脂高糖飲食6周，禁食24h，腹腔注射STZ 30mg·kg-1，72h后連續(xù)3d尾靜脈取血，用強生穩(wěn)擇易血糖儀檢測血糖含量在16.7以上者為造模成功，作為糖尿病實驗對象。實驗期間大鼠繼續(xù)輔以高脂高糖飲食，每周觀測血糖，每天監(jiān)測體質(zhì)量。實驗結(jié)束時，去除中間死亡鼠及血糖恢復(fù)鼠，每組以25只作為實驗統(tǒng)計樣本。治療組于造模成功后4周開始按照0.3g/kg·d經(jīng)胃給藥，DR組給予相同劑量的溫水。

1.2.2 取材

各組大鼠以STZ注射造模成功后開始算起，分別于第6、8、10、12、14周以多聚甲醛心臟灌注處死5只大鼠，取出完整眼球，置于4 %多聚甲醛溶液固定并石蠟包埋，以行免疫組化檢測。

1.2.3 免疫組化

取大鼠眼球，經(jīng)固定，石蠟包埋，切片，烤片制成組織芯片，脫蠟、梯度酒精至水，PBS沖洗，枸櫞酸鹽酸緩沖液微波加熱抗原修復(fù)，3%H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化酶，PBS沖洗，山羊血清封閉，一抗孵育4℃過夜，PBS沖洗，二抗孵育30min，PBS沖洗，DAB顯色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(即)表示，采用單因素方差分析法，各組間比較采用LSD檢驗和Dunnet’s T3檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FN在各個時期的表達

見表1。

2.2 CD105在各個時期的表達

見表2。

表1 FN在大鼠視網(wǎng)膜中各時期的表達

*vs空白組P<0.05，**vs空白組P<0.01，△vs對照組P<0.05，△△vs對照組P<0.01。

表2 CD105在大鼠視網(wǎng)膜中各時期的表達

vs空白組P<0.01，vs對照組P<0.01。

3 討論

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)是一個多因素的復(fù)雜疾病過程。我國糖尿病患者中糖尿病性視網(wǎng)膜病變的患病率達44%～51.3%[4]。在組織學(xué)上，糖尿病性視網(wǎng)膜病變的改變主要是毛細血管功能和結(jié)構(gòu)的異常改變，血管的通透性改變，出現(xiàn)微血管瘤和新生血管等；在分子水平上，則是促進新生血管因子與抑制因子之間的平衡被打破。當糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展到一定階段時, 視網(wǎng)膜組織隨著缺血缺氧的加重, 視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生一系列因子促使新生血管生成新生血管的形成,包括毛細血管基底膜的降解、內(nèi)皮細胞的遷移增殖以及管腔的形成[3]。本研究擬從糖尿病大鼠模型以及糖尿病視網(wǎng)膜病理改變?nèi)胧?，利用鏈脈佐菌素(STZ)腹腔注射，配合高脂高糖飲食建立糖尿病大鼠模型，觀察大黃素對大鼠視網(wǎng)膜病理形態(tài)學(xué)改變以及對視網(wǎng)膜免疫組化處理后FN和CD105表達的改變。纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是一種大分子多功能的細胞外基質(zhì)糖蛋白，可由內(nèi)皮細胞、上皮細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞等多種細胞產(chǎn)生，廣泛存在于細胞表面、細胞外液、結(jié)締組織及大部分基底膜。在其它疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，細胞外基質(zhì)成分中的纖維黏連蛋白在增進細胞的黏附，促進細胞的遷移及分化，參與細胞骨架構(gòu)建及細胞形態(tài)的形成中有著活躍的功能。CD105具有特殊的組織學(xué)標記，在內(nèi)皮細胞顯著表達，并能選擇內(nèi)皮細胞，在人類微血管內(nèi)皮細胞和增生的血管內(nèi)皮細胞中，CD105已被檢測出大量表達于細小的和尚未成熟的血管中，尤其在再生組織和炎癥組織中。本實驗表明，在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中，F(xiàn)N與CD105的表達均高于正常大鼠，且與疾病進展成正向的相關(guān)性，在應(yīng)用大黃素進行藥物治療后，F(xiàn)N的表達結(jié)果較未治療組明顯著下降，而CD105的表達則呈顯著下降。因此大黃素對DR有一定的治療作用，可能通過其抗炎作用而抑制新生血管及纖維組織的增生，這為DR的治療提供了一個新的視角。

[1]王翔飛，葛均波，孫愛軍，等．大黃素通過p53途徑抑制血管平滑肌細胞增殖的實驗研究[J].中華心血管病雜志，2006，34(1)：44

[2]劉光輝．大黃素對高糖條件下VEGF 表達及人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖的影響[D].衡陽：南華大學(xué)，2012

[3]王虹, 吉雷, 劉遠光，等.結(jié)締組織生長因子與糖尿病并發(fā)的眼部缺血缺氧性疾病[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011，36(6)：72

[4]崔翠,齊艷秀,宿星杰，等.糖尿病性視網(wǎng)膜病變的病因與治療的研究進展[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011，34(3)：68